高强度间歇训练对中年大鼠心肌细胞增殖/凋亡的影响

陈乐琴 李倩倩 闫海龙 张一民

1 山西师范大学体育学院（山西临汾041000）

2 北京体育大学（北京100084）

细胞凋亡是指在基因控制下细胞有序死亡的形式。研究表明，心肌中同样存在细胞凋亡[1]，细胞凋亡具有维持心脏正常形态结构等方面的作用，与心脏的生理、病理发展过程有关。与坏死不同，细胞凋亡的发生有积极的生物学意义，与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用。随着研究技术的不断发展，众多学者对心肌细胞不再增殖的传统观点提出了质疑，指出正常心脏中存在固有干（祖）细胞[2]，心肌细胞有增殖能力[3-4]。细胞增殖和凋亡过程通过细胞因子相关联，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。近些年，心血管疾病发病致死已成为人类死亡的首位原因[5-6]，而通过运动提高人体心肺耐力可以有效降低心血管疾病患病风险[7]。

高强度间歇性训练（high intensity interval train⁃ing，HIIT）是一种以超过无氧阈强度或是接近于或大于最大摄氧量强度进行重复多次的相对较短时间（如10 s～5 min）运动的方式。过去十年，已经有研究证明[8-10]，HIIT 在心脏康复中的良好效果，HIIT 比中等强度持续运动更有益于中等以及严重心脏病人的健康恢复，能够减少健康个体的死亡率[11]，减少老年人的心脏病风险[12]。众多研究已经显示，细胞凋亡与增殖是运动锻炼影响机体健康的重要生理机制，但研究多关注青年与老年阶段，而对于青年向老年过渡的中年阶段则极少有报道。本研究通过选取目前备受关注的高强度间歇训练干预方式，来探讨其对中年大鼠心肌细胞凋亡与增殖相关蛋白表达及最大摄氧量的影响，为高强度间歇训练在人群中（尤其是中老年人）的应用提供数据支持。

1 对象与方法

1.1 实验对象与分组

本研究选取9月龄的70只清洁级雄性Wistar 大鼠为实验对象[13，14]。将大鼠适应性喂养1周后，随机分为基础值组（B 组），4 周安静对照组（Q1 组）、4 周中等强度运动组（M1组）、4周HIIT组（H1组）和8周安静对照组（Q2 组）、8 周中等强度运动组（M2 组）、8 周HIIT 组（H2组），每组10只。所有大鼠均在清洁级环境下分笼饲养，自由采食与饮水，动物房温度为25℃，12 小时明暗周期交替。

1.2 实验运动方案

安静对照组：不进行运动。

中等强度运动组：大鼠进行跑台训练。实验运动前进行VO2max 测试，并根据测试结果，确定运动强度为60%VO2max[15]进行训练，每天训练1 次，每次50 min，每周5 d。M1组训练4周，M2组训练8周。

HIIT 运动组：实验运动前进行VO2max 测试，并根据测试结果及大鼠达到最大摄氧量时的跑台运动速度，参考梁春瑜等[16]方案设计，确定HIIT运动方案。H1与H2 组每天训练1 次，每次50 min，每周训练5 d，H1组训练4周，H2组训练8周。运动方案见表1。HIIT运动组与中等强度运动组的平均运动强度相同，均为60%VO2max（平均运动强度=总运动量/总运动时间HI⁃IT 组总运动量=（60%VO2max×7 min×1 次）+（80%VO2max×3 min×6 次）+（50%VO2max×3 min×6 次）+（60%VO2max×7 min×1 次），HIIT 组总运动时间=50min，HIIT 组平均运动强度=总运动量/总运动时间=63.6%VO2max）。

实验开始后，干预组大鼠每两周记录一次最大摄氧量测试数据，并根据最大摄氧量测试结果重新调整运动强度。

表1 HIIT组训练方案

1.3 VO2max测试方案

所有大鼠在正式实验开始前及训练至第2、4、6、8周末时均进行VO2max测试。最大摄氧量测试根据Le⁃andro 等[17]的研究进行改良，具体测试方案见表2。大鼠达到最大摄氧量的判断标准为：1.大鼠在电刺激的情况下不能在跑台上继续跑。2.两级之间的VO2max/一级速度之间相差小于5%。测试仪器为开放环路量热计（OxymaxDeluxe System，哥伦布仪器，美国）。

表2 VO2max测试方案

1.4 取材与心肌指数的测量计算

基础值组大鼠在首次最大摄氧量测试结束后24 h取材，安静对照组与干预组大鼠均在干预第4、8 周最大摄氧量测试结束后24 h 进行取材。每次取材前先称取大鼠体重，后用2%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，迅速摘取心脏称重，随后转入－80℃冰箱中保存，用于Western Blotting 法测试。心脏称重后以心脏重量与体重比值计算心肌指数（心肌指数=心脏重量/体重，mg/g）[18]。

表3 取材安排

1.5 Western Blot 检测

对凋亡与增殖相关蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-Associated X，Bax）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lym⁃phoma-2，Bcl-2）、活化半胱天冬蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、活化聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（cleaved poly ADP- ribose polymerase- 1，Cleaved PARP-1）、增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclear an⁃tigen，PCNA）进行Western Blotting 检测。

取心肌100 mg加入1 mL含有蛋白酶抑制剂的裂解液中低温匀浆，使细胞充分裂解后置于4℃离心机离心，12000 转离心10 min，取上清液。随后用Thermo Fisher 的BCA 试剂盒测定并调整蛋白浓度一致，加入蛋白上样缓冲液，配平上样量，70℃水浴10 min使蛋白变性后分装样品。

加样到预制胶（NuPAGE® Novex 12%Bis-Tris Gel）置于电泳槽，加入5%体积的电泳缓冲液，120 V电泳90 min；转膜（转膜缓冲液：Tris 3.03 g/L、甘氨酸14.41 g/L、甲醇200 mL/L、蒸馏水）约90 min；5%脱脂奶粉封闭1 h；一抗孵育：Bcl-2（Santa Cruz，1∶200）、Bax（Abcam，1∶2000）、Cleaved Caspase-3（CST，1∶500）、PCNA（Santa Cruz，1∶200）、Cleaved PARP-1（Santa Cruz，1∶500）、GAPDH（Abcam，1∶20000），封闭4℃摇床过夜，次日用TBST洗膜8 min×4；二抗孵育：羊抗小鼠（Abcam，1 ∶20000）、羊抗兔（Abcam，1 ∶30000），封闭1 h，后用TBST 洗膜8 min×4；化学发光成像系统（Bio-rad公司，美国）曝光显影。

1.6 数据处理与分析

测试条带采用Image Lab 4.0 进行数据采集。所有实验数据用平均数±标准差（x±s）表示，运用SPSS17.0 进行数据统计分析，总体分析采用双因素方差分析，组内两两对比采用单因素方差分析进行处理，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体重测量结果

见表4、5，单因素方差分析结果显示，运动干预4周时，HIIT 组大鼠体重与安静组相比显著下降（P＜0.05）；运动干预8 周时，与安静组相比，中等强度运动组大鼠体重显著下降（P＜0.05），HITT 组大鼠体重显著下降（P＜0.01）。双因素方差分析结果显示，运动方式对大鼠体重具有非常显著的影响（P＜0.01），但训练周数对大鼠体重无显著影响（P＞0.05），两个影响因素也无交互作用（P＞0.05）。表明HIIT控制大鼠体重增长比中等强度持续运动更为快速有效。

表4 8周运动干预大鼠体重变化结果（g）

表5 大鼠体重双因素方差分析结果

2.2 大鼠心肌指数测量结果

见表6、7，单因素方差分析结果显示，干预8 周后从安静组到中等强度运动组再到HIIT 组，心肌指数呈现上升趋势，其中HIIT 组显著高于安静组（P＜0.05）。双因素方差分析结果显示，运动方式对大鼠心肌指数有显著的影响（P＜0.05），但训练周数对大鼠心肌指数无显著影响（P＞0.05），两个影响因素也无交互作用（P＞0.05）。可知，HIIT较中等强度持续运动明显提高了心肌指数。

表6 8周运动干预大鼠心肌指数变化结果（mg/g）

表7 大鼠心肌指数双因素方差分析结果

2.3 VO2max测试结果

见表8、9，单因素方差分析结果显示，4 周时HIIT组VO2max 相比干预前显著提高（P＜0.01），与同周安静组和中等强度运动组相比均显著提高（P＜0.01，P＜0.05）；8 周时HIIT 组VO2max 相比干预前显著提高（P＜0.01），与同周安静组相比显著提高（P＜0.05）。双因素方差分析结果显示，运动方式与训练周数对大鼠VO2max 均有非常显著的影响（P＜0.01），且存在交互作用影响（P＜0.01）。可知，HIIT 较中等强度持续运动明显提高了VO2max。

表8 8周运动干预大鼠VO2max变化结果（mL/kg/hr）

表9 大鼠VO2max双因素方差分析结果

2.4 大鼠心肌细胞凋亡与增殖相关蛋白表达结果

如图1所示，Bax蛋白表达：与Q1组相比，M1与H1组显著下降19.3%、17.4%（P＜0.01）；Q2组与B组、Q1组相比显著下降19.0%、25.7%（P＜0.01）；H2 组与Q2 组、M2组相比显著提高23.5%、22.2%（P＜0.01，P＜0.05）。

Bcl-2 蛋白表达：Q2 组与Q1 组相比显著下降22.0%（P＜0.05）；M2 组与M1 组相比显著下降21.4%（P＜0.05）。

Bax/Bcl-2 比值：4 周时各组无显著差异（P＞0.05）；8周时各组总体呈上升趋势，H2组与H1组、Q2组和M2组相比显著提高53.8%、56.8%、34.7%（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。

如图2所示，Cleaved Caspase-3 蛋白表达：4 周时各组无显著差异（P＞0.05）；8 周时各组总体呈上升趋势，H2组与H1组、Q2组和M2组相比显著提高24.2%、33.7%、18.3%（P＜0.05）。

如图3所示，Cleaved PARP-1 蛋白表达：与Q1 组相比，M1 与H1 组显著下降20.4%、22.5%（P＜0.01）；Q2组与B组、Q1组相比显著下降43.0%、38.7%（P＜0.01）；M2组比Q2组显著上升15.8%（P＜0.01）；H2组与Q2组、M2组相比显著提高45.6%、25.8%（P＜0.01）。

如图4所示，PCNA 蛋白表达：与B 组相比，Q1 与Q2组显著下降18.0%、42.0%（P＜0.05，P＜0.01）；Q2组与Q1组相比显著下降23.2%（P＜0.01）；H2组与Q2组、M2组相比显著提高65.5%、52.4%（P＜0.01）。

图1 各组大鼠心肌细胞免疫印迹Bax/Bcl-2结果比较

图2 各组大鼠心肌细胞免疫印迹Cleaved Caspase-3/GAPDH结果比较

图3 各组大鼠心肌细胞免疫印迹Cleaved PARP-1/GAPDH结果比较

图4 各组大鼠心肌细胞免疫印迹PCNA/GAPDH结果比较

3 分析与讨论

3.1 HIIT对大鼠体重、心肌指数的影响

在动物模型和受试者研究中表明，HIIT 是预防体重增加、减少脂肪堆积的高效手段[19，20]，相比中等强度持续运动效果更好[21，22]，用时更短[23]。运动不仅对控制体重有着重要的作用，还会对心脏形态结构与功能产生良好影响。长期系统运动训练可使心脏发生适应性肥大，可发生在左、右心室和心房，以左心室增大为主。Holloway 等[24]在研究中对高血压大鼠进行HIIT 干预，结果大鼠左心室质量增加20%（P＜0.05），表明HIIT促进了高血压大鼠左心室的病理适应。田振军等[25]对3月龄青年大鼠进行8周有氧运动后，大鼠心系数显著增加，心率（HR）和左心室舒张末压（LVEDP）显著下降，左心室收缩压（LVSP）和左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）显著升高，表明有氧训练使心脏发生适应性肥大，提高了左室舒缩功能。本实验将关注对象的年龄推后定位到9月龄的中年大鼠，结果显示，与安静组相比，8周的HIIT有效控制了中年大鼠体重的增加，提高了心肌指数，且与中等强度运动组相比，起效更快，效果更显著，这就为心功能的稳定与提升奠定了基础。

心功能受损、炎性细胞因子增加和氧化应激升高是衰老和心血管疾病的常见现象。目前认为，心脏质量的显著减少直接导致收缩功能受损、心肌病、心脏病和心力衰竭[26]，与年轻人相比，70岁的老年男性心脏质量减少了30%[27]。本研究发现，约9～11月龄的自然增龄中年大鼠心肌指数已经出现了下降趋势，推测之后不管是维持现有水平还是继续降低，均不能为今后的老年时期提供良好的质量基础，提示，中年时期的运动干预对预防和延缓老年性心功能退变是必要的。

3.2 HIIT对大鼠最大摄氧量的影响

最大摄氧量是评价机体心肺耐力的金标准，HIIT能够提高超重成年人的最大摄氧量[28]，并有助于改善肥胖患者的心脏代谢，提高心肺耐力，降低血浆脂质[29]。在动物实验中，王林佳等[30]对6周龄大鼠进行10周的HIIT与中等强度持续运动干预，发现HIIT组大鼠最大摄氧量出现稳定上升趋势比中等强度持续运动组早，10周时HIIT组大鼠最大摄氧量已显著高于中等强度持续运动组。这与崔新雯等[31]研究中有关HIIT对大鼠有氧运动能力影响的研究结果一致，该研究在对9月龄大鼠进行12 周的HIIT 与中等强度持续运动干预后发现，相比中等强度持续运动，HIIT显著提高了最大摄氧量，且两种运动方式显著提高了大鼠力竭运动时间和距离。

上述研究表明相对于中等强度持续运动，HIIT在提高机体最大摄氧量，提高心肺耐力方面更为快速有效。老龄化的特征是心功能的逐渐下降，包括心输出量、血流量和耗氧量等，严重影响有氧运动能力[32]。本研究中，9月龄大鼠已属于中年大鼠，但安静组大鼠最大摄氧量无下降趋势，推测9～11月龄的中年大鼠有氧运动能力可能仍处于较高水平。中等强度运动组最大摄氧量呈上升趋势，但无显著性，推测中等强度运动对最大摄氧量的提升所需时间较长，而HIIT 组大鼠最大摄氧量在4周时就已经表现出显著提升，并且保持到8周实验结束，表明HIIT 对最大摄氧量的提升效果更为快速有效，这对后期积极应对老年大鼠有氧运动能力的下降具有重要意义。另外，本研究中最大摄氧量采用（mL/kg/hr）相对值表示，可排除体重对最大摄氧量的影响。

3.3 HIIT对大鼠心肌细胞凋亡与增殖相关蛋白表达的影响

心肌细胞在胚胎发育末期已经基本分化成熟，由于某种细胞周期抑制因子的作用，形成G1/S 期限制点（R 点）屏障细胞不再合成DNA，因而失去了分裂增殖能力[33]。因此，过去一直忽视了心肌细胞发生凋亡的可能。但有研究发现，不管是静止状态还是运动状态，心肌细胞都会出现一定水平的凋亡[34]。文献报道，运动负荷与心肌细胞凋亡关系密切。Carraro等[35]在关于运动与心肌细胞凋亡的研究中发现，不管是短时间还是长时间的剧烈运动都会导致心肌细胞的不正常凋亡。Li等[36]通过观察耐力训练和急性力竭运动后大鼠心肌细胞凋亡情况发现，急性力竭运动组心肌组织中Bcl-2表达明显降低，Bax表达、心肌细胞凋亡指数明显增加，耐力训练组Bcl-2表达明显上调，Bax表达、心肌细胞凋亡指数显著降低。胡亚哲等[37]研究证实，有氧训练可使大鼠心肌细胞凋亡适度增加，过度训练则使大鼠心肌细胞凋亡显著升高，提示运动强度越大心肌细胞凋亡越明显，一氧化氮（NO）可能是产生细胞凋亡的诱因。张钧等[38]研究发现长期中等负荷的运动可抑制大鼠心肌细胞凋亡，而力竭运动和过度训练可促进心肌细胞凋亡。

以上研究均表明，适宜的运动刺激下，心肌细胞凋亡发生的比率增加不多，且在某种条件下还有可能抑制心肌细胞的凋亡，增强心肌细胞抗凋亡的能力，而反复大强度运动可引起心肌细胞凋亡发生的比率明显增加，对心脏造成很大损伤。上述研究多为青壮年鼠，而对老年大鼠的研究也得出了同样的结论，王永良[39]在对自然老化的16月龄大鼠进行不同负荷游泳运动干预后发现，随着运动负荷的增加，老龄大鼠心肌细胞凋亡水平呈递增趋势。这表明，大负荷运动促进老龄大鼠心肌细胞凋亡的发生，而适宜运动能够抑制心肌细胞凋亡发生。这对运动减缓由衰老引起的心肌细胞数量流失具有重要意义。衰老的特征是心肌细胞减少、重构和心脏收缩功能受损。随着年龄的增长，左心室程序性细胞死亡的比率增加，导致心肌细胞减少30%，而运动可以保护老化心脏的心脏功能[40]。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主性死亡的过程，在众多调控凋亡的因子中Bcl-2 家族和Caspase 家族发挥着重要作用。B 细胞淋巴瘤-2 基因（Bcl-2）是凋亡抑制基因，Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）是促进凋亡的基因，Bax/Bcl-2 的比率形成了细胞凋亡的“分子开关”，Bax/Bcl-2升高细胞趋于凋亡，反之细胞凋亡受到抑制。而凋亡的细胞死亡最终由Caspase 家族完成。Cleaved Caspase-3 是细胞凋亡的执行者，能够水解下游底物，切断DNA，导致细胞凋亡[41]。PARP-1 是存在于真核细胞中能有效修复DNA 损伤的核酶[42]，是Cas⁃pases-3 的重要底物并被其抑制。当Cleaved Caspas⁃es-3 将PARP-1 剪切裂解为Cleaved PARP-1 时，PARP-1 失去对DNA 的修复作用，细胞凋亡水平上升。因此Cleaved PARP-1 被视为凋亡的一个重要标记物[43]。

本研究中探索了HIIT对中年大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响，试图为激活最佳凋亡水平的有效运动方式提供依据。通过对细胞凋亡调控基因Bax、Bcl-2 和凋亡标志蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP-1进行检测发现，中等强度持续运动组干预4周时，Bax/Bcl-2 比率有所下降，但无显著性；8 周时与同期安静组相比中强度持续运动组Bax/Bcl-2比率上调，但仍无显著性，而HIIT组Bax/Bcl-2比率显著上调。凋亡标志蛋白Cleaved Caspase-3表达的变化趋势与Bax/Bcl-2 比率基本相同，8 周的HIIT 干预显著提高了Cleaved Caspase-3 蛋白表达，表明8 周的HIIT 干预显著提高了中年大鼠心肌细胞凋亡水平。值得注意的是，在Bax/Bcl-2比率变化中，Bax蛋白表达变化的显著性远远高于Bcl-2，推测在实验条件下，中年大鼠心肌细胞中Bcl-2对两种运动方式的诱导并不敏感，细胞凋亡“分子开关”的倒向主要由Bax 蛋白表达决定。本研究中，Cleaved PARP-1 蛋白表达趋势与Cleaved Cas⁃pase-3 基本相同，这也印证了Bax/Bcl-2 比率与Cleaved Caspase-3表达所反映心肌细胞凋亡水平的变化，而Cleaved PARP-1 表达变化的显著性更高，推测是因为Cleaved PARP-1 处于凋亡调控的下游而产生了“级联放大效应”。文献报道，衰老导致线粒体介导的凋亡途径增加，包括Bax/Bcl-2 比率提高，Caspase-9和Cleaved Caspase-3表达提高导致细胞凋亡增加。然而，长期耐力运动训练逆转了凋亡相关蛋白表达的升高，提示运动训练能有效抑制由于衰老引起的细胞凋亡增加[44]。本实验中大鼠月龄处在青年向老年过渡的中年阶段，4周运动干预中，随着有氧运动能力的提升，大鼠心肌细胞凋亡水平表现出下降趋势，而8 周时尤其是HIIT 组凋亡水平显著提升，可能是由于本实验中大鼠跑速是不断提高的，尤其是HIIT 干预会不断对大鼠心肌产生新的生理性刺激，且当心肌受到过度牵张被拉长或受到机械应力作用导致容量和压力超负荷时心肌细胞凋亡会增加[45]。而从8 周大鼠心肌指数及最大摄氧量的提高看，心肌细胞凋亡水平的提高并未对心脏产生过多不良影响，推测这是受损的心肌结构与功能的自我恢复以及心肌细胞的自我更新与清除，是对运动训练的适应表现。

PCNA 的蛋白表达变化情况也支持了上述推论。研究证实，正常心脏存在着固有干（祖）细胞[2]，心肌细胞确有增殖能力[3-4]。尽管其增殖能力非常有限，且更新率随年龄增长而逐渐降低[3]，但在维持心功能稳定和受损心肌恢复方面，具有重要意义。增殖细胞核抗原（PCNA）是细胞周期标记蛋白[46]，它们由3 个首尾相接的同源单体组成，每个单体含有空间结构相同的两个结构域，因此每个PCNA 分子有6 个重复的结构域，形成一个六边对称的封闭环状，围绕着DNA 双链并将复制聚合酶固定在基因组模板上，是真核染色体DNA 复制和修复的重要组成部分[47]。周云鹤等[48]对2月龄小鼠进行4 周有氧运动和过度运动训练发现，运动能有效刺激小鼠心脏，促进心肌增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，改善心脏功能，且有氧运动对心脏形态和功能的改善作用大于过度运动。田振军等[25]研究也发现有氧运动可促进心肌细胞增殖相关蛋白PCNA 的表达，诱导心肌细胞的增殖。本研究发现，随着周龄的增长，非干预组大鼠心肌细胞PCNA 蛋白表达显著下降，提示大鼠在中年阶段心肌细胞增殖水平就已经开始下降。而运动干预8周后，HIIT组PCNA表达相比同期安静组显著升高，中等强度持续运动组PCNA 表达虽也有升高，但无显著性。这表明8 周的HIIT 可有效诱导中年大鼠心肌细胞增殖，抑制因增龄引起的增殖水平下降，而通过有氧运动诱导中年大鼠心肌细胞增殖的效果已不理想。

4 结论

（1）8周HIIT 干预能够有效控制中年大鼠体重增长，提高心肌指数，提高最大摄氧量；

（2）8周HIIT 干预会使中年大鼠心肌发生适应性改变：一方面提高Bax/Bcl-2 比率，上调Cleaved Cas⁃pase-3、Cleaved PARP-1 蛋白表达，诱导细胞凋亡；另一方面上调PCNA蛋白表达，诱导细胞增殖。