膝关节前交叉韧带断裂对健侧膝关节软骨影响的实验研究

钟名金 敖英芳

1 深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）运动医学科（深圳518000）

2 北京大学第三医院运动医学研究所（北京100191）

膝关节前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）断裂是临床上常见且严重的伤病[1]。ACL断裂后患膝关节失稳，胫骨出现反常的前向移动，使关节接触面和应力发生变化，导致关节软骨损伤[2，3]。一侧膝关节ACL 断裂后，在日常活动和运动过程中，为保护患膝，健侧膝关节将代偿性地承受更多的负担[4]。切断狗一侧后肢ACL 后，另一侧后肢的负重较正常情况下增加12.8%～31.7%[5]。而持续的负载增加将会对关节软骨产生不利影响[6，7]。我们的前期临床研究也发现，双膝ACL断裂的患者由于双膝关节的生物力学和运动平衡机制打破，双膝关节相互影响，造成对侧膝关节代偿性负重增加，使得关节软骨损伤的发生率和严重程度更高[8]。因此，本研究通过动物实验进一步观察一侧膝关节ACL 断裂后在日常活动和运动条件下对健侧（contralateral，CL）膝关节软骨的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年新西兰大白兔30 只，4～5月龄，体重2.5～3 kg，由专业饲养员分笼饲养，所有动物均可充分获得食物和饮用水。

1.2 动物活动和运动方案[9]

采用兔运动训练跑台（北京智鼠多宝生物科技公司）模拟兔的日程活动和运动。跑台主要由跑道、电机、操作台、升降机等构成。跑台内含3 个跑道，规格为（1560 mm×996 mm×280 mm），长度适用于兔的奔跑，跑道速度由电动马达驱动，速度可无级调整，范围为1～40米/分。兔运动开始于术后第5天，每周5天，每天10分钟，跑台速度为0.3英里/小时（约8米/分钟），其余时间在专业饲养笼（590 mm*420 mm*400 mm）里自由活动。

1.3 手术方法[9]

ACL 切断（ACL transection，ACLT）：采用耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 ml/kg）对动物进行全身麻醉，右膝关节为术侧，将膝关节固定、备皮、消毒及铺巾，经膝关节内侧髌旁切口，逐层分离至打开关节腔，将髌骨向外侧脱位后屈膝下完全暴露ACL，用眼科剪在韧带中段予以切断并剪除2 mm 韧带组织防止粘连愈合，行Lachman 试验确定韧带完全切断，生理盐水冲洗关节腔，将髌骨复位，严密缝合关节腔及皮肤。假手术：动物采用相同的切口在相同条件下切开皮肤和打开关节腔，暴露ACL 但不予以切断，生理盐水冲洗后关闭伤口。为防止术后关节感染，术后予以每只动物肌注40万单位的青霉素，连续3天。

1.4 实验分组

兔经过1 周的适应性笼养后，根据手术方式的不同随机平均分为两组：ACL 切断组（ACLT/CL）和假手术组（Sham/CL），每组分别于术后12周、24周和36周处死兔子，获取完整的左膝关节（CL），每次每组5 只兔子。

1.5 大体形态观察

解剖膝关节，充分暴露股骨髁，观察股骨内髁软骨的大体形态，采用如下评分标准进行评价[10]：0分：软骨表面光滑，色泽光鲜。1分：局部软骨面粗糙、纤维化或出现轻度的色泽发黄。2分：软骨裂隙延伸至软骨表层或中层。3 分：软骨面裂隙至软骨深层。4 分：软骨剥离，软骨下骨暴露。

1.6 组织学和二型胶原（COLⅡ）免疫组化染色

大体观察后将兔膝关节固定于4%的中性多聚甲醛固定溶液中，固定72小时。标本经固定后自来水冲洗，用10%甲酸脱钙液进行脱钙，每日更换脱钙液至脱钙充分，标本用蒸馏水漂洗，至恢复中性pH。修整软骨组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋后，以5 μm/层切片，行苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin，HE）、甲苯胺蓝染色（Toluidine Blue）。组织学评分采用国际骨关节炎研究会（Osteoarthritis Research Society Interna⁃tional，OARSI）推出的关节软骨组织病理学评分系统（OARSI 总分为24 分）[10]，此评分系统能准确评估软骨损伤情况。对软骨组织切片采用“二步法”进行COLⅡ免疫组化染色用于观察软骨基质的COLⅡ含量变化。

1.7 统计学计算

大体观评分和OARSI 评分数据采用Mean±SD 表示，采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，进行配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观

ACLT/CL组：术后12周股骨内髁软骨表面完整，个别出现软骨表面色泽发暗；术后24周软骨表面出现局限性变薄，色泽鲜亮感消失，负重区软骨出现压痕、表面毛糙；术后36周软骨损伤更加明显。Sham/CL组：术后12 周、24 周和36 周，股骨内髁软骨均光滑，色泽红润，未见明显软骨损伤（图1）。大体观评分结果显示，术后24周、36周，ACLT/CL组和Sham/CL组在大体观评分上均存在统计学差异（P＜0.05）（图2）。

图1 股骨内髁关节软骨大体观

图2 股骨内髁软骨大体观评分

2.2 组织学染色

ACLT/CL 组：术后12 周，股骨内髁软骨染色均匀，个别软骨表面浅表粗糙，但软骨整体结构完整。糖原含量丰富，COLⅡ表达丰富，呈深染状态；术后24周，软骨可见损伤，软骨浅层裂隙，达软骨的浅-中层，糖原染色减退、变淡，浅层软骨COLⅡ出现淡染表现；术后36周，软骨损伤结构损伤达到中层，糖原丢失，软骨表面COLII 失染。Sham/CL 组：术后12 周、24 周和36 周，关节软骨结构层次清晰，糖原及COLⅡ含量丰富。

OARSI 评分结果显示，术后24 周和36 周，ACLT/CL组和Sham/CL组在OARSI评分上均存在统计学差异（P＜0.05）。

图3 股骨内髁软骨组织学染色及COLⅡ免疫组化染色

图4 股骨内髁软骨OARSI评分

3 讨论

一侧膝关节ACL断裂后将对健侧膝关节产生影响早已受到关注[10-15]。Fremerey 等[11]研究认为，ACL 的急性损伤会导致患膝关节本体感觉的全面下降，而且对侧膝关节本体感觉的受损也有统计学意义。Edixhoven等[12]应用Lachman 试验（－180～180 N）测试急性ACL断裂、慢性ACL 断裂患者和健康人群膝关节的稳定性发现，与健康人群相比，ACL断裂后不仅造成患膝关节不稳，而且对侧膝关节的稳定性也明显下降。Shino等[13]使用200 N的力测试了91名单侧ACL断裂患者的对侧膝关节前向稳定性，其中22例患者对侧膝关节出现明显前向松弛。这表明一侧膝关节不稳将造成对侧膝关节不稳。黄红拾等[14]应用步态分析仪测量ACL断裂后双下肢的步态特征发现，ACL断裂后，另一侧下肢足底压力在某些时相上与健康人具有明显差异，提示对侧下肢的步态改变，足-膝偶联机制破坏。马勇等[4]认为，一侧膝关节ACL断裂后，患者在从事某些特殊动作如急转、落地等动作时，有意识地保护伤侧膝关节，从而大大增加了健侧膝关节ACL损伤的风险。Ohno等[15]发现，ACL 断裂将造成对侧膝关节周围肌肉萎缩和收缩性能下降。因此，一侧膝关节ACL 断裂将对健侧膝关节产生整体、全面的影响。

研究表明，关节软骨对应力变化异常敏感。膝关节生物力学机制改变、应力增加、周围肌肉萎缩导致的肌肉力量下降等异常因素均可引起关节软骨损伤，最终导致膝关节骨关节炎（osteoarthritis，OA）[16，17]。Zhou等[18]把兔一侧膝关节用石膏固定而对侧膝关节不固定，造成兔仅使用一侧膝关节负重活动，2 周后石膏固定侧膝关节出现软骨磨损，而负重侧膝关节在4 周后也出现软骨退变现象。Thomas 等[7]切断小鼠一侧膝ACL 和切除部分内侧半月板并让其在旋转转盘（rotat⁃ing cylinder）上运动，术后20周取对侧膝关节软骨进行特殊免疫组化染色发现，软骨细胞内金属基质蛋白酶-13（MMP-13）和十型胶原（COLⅩ）表达明显增加，而MMP-13 和COLⅩ是关节软骨发生退变的标志物。Chen 等[19]使用3-D MRI 技术对单侧膝关节ACL 断裂的患者进行双膝关节软骨接触面积扫描，并与健康未受伤的人群进行比较后发现，ACL 断裂不但造成伤侧膝关节内侧间室关节软骨接触面积改变，也会改变对侧膝关节关节软骨的接触面积。Makela 等[20]通过手术方法切断兔ACL断裂造成早期OA，并取对侧膝关节软骨进行生物力学检测发现，对侧膝关节外髁软骨的动态弹性模量只有正常软骨的30%，引起这种改变的原因是表浅软骨组织的组成成分出现微小变化，造成软骨组织生物力学特性的下降，是一种非常早期退变的表现。但他们的实验仅观察了术后4周，时间较短，且实验动物也仅限笼养，无法模拟动物膝关节的日常活动和运动，因此，他们只检测到软骨组织力学特性的早期变化，而并未发现软骨结构性的损伤。本实验运用实验跑台模拟了ACL 断裂后的日常活动和运动条件，通过切断兔一侧膝关节ACL 制作ACL 断裂模型，在较长时间的活动和运动条件下，观察到健侧膝关节软骨在术后24周出现关节软骨损伤，大体观上表现为软骨浅层磨损、浅表裂隙，术后36 周时关节软骨损伤更加明显，表现为软骨部分缺损，裂隙深度达软骨中层，软骨糖原和COLⅡ丢失，软骨细胞出现集簇增生。相比之前的研究，本实验观察时间较长，并证实一侧膝关节ACL 断裂后较长时间内将造成健侧膝关节软骨损伤。ACL断裂造成健侧膝关节软骨损伤的最主要原因是患侧膝关节长期处于失稳状态，在活动过程中健侧膝关节将代偿性地增加负重，长此以往，关节软骨在异常过载下出现软骨损伤。结合我们的前期临床观察，本实验进一步证实了一侧膝关节ACL断裂后在较长期日常活动和运动条件下将对健侧膝关节软骨产生不利影响，造成软骨损伤。这需要后期开展更加完善的生物力学研究进行印证。

本实验的不足之处在于：（1）本实验以大体观和组织学染色评估关节软骨损伤可能导致发现软骨损伤的时间延迟；（2）兔膝关节虽然与人体膝关节类似，但兔膝关节长期处于微屈状态，软骨负重区与人体存在一定差异；（3）本实验只对股骨内髁软骨进行评估，未对其他组织如半月板、滑膜、关节液生化成分进行检测。

4 结论

本研究表明膝关节ACL断裂后在较长期日常活动和运动条件下将造成健侧膝关节软骨损伤。临床上应重视膝关节ACL断裂后由于膝关节不稳对健侧膝关节整体的影响，尤其是关节软骨损伤。