长期高强度间歇训练加重自发性高血压大鼠心肌纤维化

黄红梅 胡宗祥 刘昭强 薄海 彭朋

1 集美大学体育学院（福建厦门361021）

2 中国人民武装警察部队后勤学院卫生勤务系（天津300309）

高血压患者由于血压升高（压力超负荷）激活神经-内分泌系统，造成心肌细胞、非心肌细胞及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）基因表达发生改变，使心脏结构、代谢与功能经历长期的模式改建过程，称为心脏重塑（cardiac remodeling）[1]。心肌ECM 在心脏生长发育、结构重塑以及功能稳态中起关键作用。心肌ECM主要成分是胶原（Ⅰ型为主，占80%以上），由成纤维细胞产生，胶原合成与降解动态平衡对于维持心脏正常结构与功能具有重要调节效应。高血压患者由于长期血压升高造成心肌胶原代谢紊乱甚至发生心肌纤维化、心肌细胞凋亡，最终引发心脏结构与功能异常甚至心力衰竭（心衰），说明ECM稳态失衡是高血压心脏重塑及病情进展的原因之一[2]。基质金属蛋白酶（ma⁃trix metalloproteinases，MMPs）是一类锌依赖性蛋白水解酶家族，催化ECM 蛋白降解，其中MMP-2 是最重要的一种MMPs，在多数细胞呈现组成型表达，其作用是降解变性胶原及其他ECM蛋白。MMPs受组织金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的负反馈性调节，以防止ECM过度降解。可见MMPs/TIMPs 稳态平衡对于维持胶原正常代谢至关重要[2]。此外，转化生长因子-β1（transforming growth fac⁃tor-β1，TGF-β1）介导的信号通路是多种疾病导致心肌纤维化的共同途径，可通过促进心肌成纤维细胞向成肌纤维细胞表型转化以及上调结缔组织生长因子（con⁃nective tissue growth factor，CTGF）等细胞因子表达，诱导纤维细胞增殖，进而促进心肌纤维化[3]。因此，MMPs/TIMPs 和TGF-β1分别是介导胶原降解与合成的主要调控因子。研究发现[2]，MMPs/TIMPs稳态失衡（降解减少）以及TGF-β1持续激活（合成增加）是高血压心肌纤维化的主要分子机制。

积极改变生活方式是高血压管理的有效手段，其中规律体力活动是健康生活方式的重要方面。研究显示[4]，中等强度持续训练（moderate intensity continu⁃ous training，MICT）是高血压患者临床康复的主要方式，能够显著改善患者心肺适能，降低血压水平，下调多种心血管危险因素，提高生活质量并降低住院率与死亡率。他人[5]以及本课题组[6-9]前期的动物实验证实，MICT还可减轻高血压大鼠心肌纤维化，促进心肌细胞再生，从而抑制病理性心脏重塑。因此，MICT 已成为多种慢性非传染性疾病（包括但不限于心衰、高血压、糖尿病、肥胖等）患者一级和二级预防的重要策略[4]。然而针对高血压患者的最佳运动康复处方仍未确定。

流行病学研究发现[10]，心肺适能是心血管疾病患者全因死亡率的强预测因子，也是评估临床与康复治疗效果及预后的重要指征。提升心肺适能包括两种训练模式，即传统MICT和近些年来新兴的高强度间歇训练（high intensity interval training，HIIT）。据报道，3次/周、共2 周的HIIT 即可改善健康无训练经历者[11]、2型糖尿病患者[12]和运动员[13]的运动能力，与MICT 产生类似的效应。然而，针对竞技运动员[14]以及实验动物[15，16]的研究显示，长期大强度耐力训练导致心肌损伤甚至发生纤维化，诱发心血管不良事件。由于HIIT 同样属于大强度运动，故推测长期HIIT 同样可造成心肌适应不良。Holloway等[17]研究发现，高盐饮食诱导的高血压大鼠进行4 周HIIT 后心脏重塑加重，心肌纤维化未得到改善；而有研究则证实，4周HIIT通过改善心肌线粒体稳态，抑制心肌梗塞（心梗）后心衰大鼠的心脏重塑[18，19]，8 周HIIT 减轻自发性高血压大鼠（spontane⁃ously hypertensive rats，SHR）心肌胶原过度沉积并延缓心衰进程[9]。因此，HIIT对心脏（尤其是病理状态下）的作用尚存在争议。鉴于此，本研究将运动干预时间由前期的8 周[9]延长至18 周（相当于人类运动10年），旨在对比MICT和HIIT对SHR心肌胶原代谢和心脏重塑的影响，并探讨TGF-β1信号通路和MMP-2/TIMP-2稳态平衡在其间的作用机制，探讨不同强度运动对病理状态下心脏的长期效应以及剂量-反应关系，为制定针对高血压患者的最佳运动康复处方提供循证依据和干预靶点，并为其它心血管系统疾病的研究、预防提供有益借鉴。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物与分组

45只3月龄雄性SHR，体质量220±18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2018-0027。同时以15 只同龄、同性别Wistar-Kyoto大鼠作为正常血压组（WKY）。大鼠饲养环境：温度20～22℃，湿度50%～60%，12∶12 h 明暗周期，分笼饲养（3只/笼），自由进食水。动物适应环境1周后利用随机数字表法将SHR 分为安静对照组（SHR-untrain⁃ing，SHR-UT 组，n＝15）、MICT 组（SHR-MT 组，n＝15）和HIIT组（SHR-HT组，n＝15），其中SHR-MT和SHRHT 组动物分别进行18 周MICT 或HIIT，SHR-UT 和WKY组则在鼠笼内安静饲养。

1.2 运动方案

所有动物先进行5 d跑台适应性训练，方案为：速度10～15 m/min，坡度0°，时间：30 min/d。随后参照本课题组前期建立的方法[9]测定大鼠运动能力：起始负荷5 m/min，坡度0°，每2 min 增加1.5 m/min，直至力竭，记录最大跑速（maximal velocity，Vmax）。

根据Hoydal 等[20]建立的大鼠跑速与最大摄氧量关系以及本课题组前期研究[9]制定18 周跑台训练方案（见表1），训练负荷（包括跑速、时间、组数以及频率）随时间逐渐递增。分别于第4、8、12 和16 周重新测定Vmax 并及时调整训练强度（跑速）。每次训练时保证两组总负荷（运动时间×运动强度×组数）基本一致。

1.3 动脉血压以及超声心电图检测

每周训练前以及末次训练后48 h，采用智能无创血压测量仪（BP-2010E，日本）测定尾动脉收缩压（sys⁃tolic blood pressure，SBP）。末次血压测定后称量体质量（body mass，BM）（g），用小动物超声影像系统（Visu⁃alSonicsVevo 3100，加拿大）进行超声心电图检测，参数包括：左心室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）、左心室舒张末期直径（left ventricular end-di⁃astolic diameter，LVEDD）、左心室收缩末期直径（left ventricular end- systolic diameter，LVESD）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.4 大鼠取材与指标检测

超声心电图检测后断头处死动物，取出心脏（分离左心室）、肾上腺和胸腺，分别称其质量（mg）并计算心脏质量指数（heart mass index，HMI）（HMI＝心脏质量÷BM）、左心室质量指数（left ventricular mass index，LVMI）（LVMI＝左心室质量÷BM）、肾上腺质量指数（adrenal mass index，AMI）（AMI＝肾上腺质量÷BM）和胸腺质量指数（thymic mass index，TMI）（AMI＝胸腺质量÷BM）。将左心室分为两部分，一部分用于心肌病理组织学观察，另一部分用锡纸包裹迅速转移至－80℃低温冰箱冻存待测基因表达。

表1 SHR-MT和SHR-HT组18周跑台训练方案

1.4.1 心肌病理组织学观察

于心脏横切面取厚度为2 mm 组织，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋并利用病理切片机（RM2255，德国）制作5 μm 切片。用Masson 染色胶原纤维，倒置相差显微镜（欧林巴斯IX71，日本）下选取10 个视野，观察胶原沉积情况，用图像分析软件（Im⁃age Pro Plus 6.0，美国）测量结缔组织面积与所测视野面积的比值，作为胶原容积分数（collagen volumetric fraction，CVF）。用HE染色心肌细胞，镜下观察细胞形态并获取细胞横截面积（cross-sectional area，CSA），所用仪器和软件同Masson染色。

1.4.2 心肌Ⅰ型胶原（type Ⅰcollagen，ColⅠ）含量检测

取适量心肌组织于磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中匀浆，4 ℃、3 000 g 离心20 min，按照试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）说明进行操作，利用紫外分光光度计（日立U-3010，日本）以比色法测定450 nm 波长处的OD 值，参照标准品计算心肌ColⅠ含量（单位为：pg/mg蛋白）。

1.4.3 胚胎基因mRNA表达检测

取心肌组织提取总RNA 后逆转录获取cDNA，随后采用RT-PCR（ABI 7500型实时荧光定量PCR仪，美国）测定胚胎基因mRNA 表达量，包括心钠素（atrial natriuretic peptide，ANP）和β-肌球蛋白重链（β-myo⁃sin heavy chain，β-MHC）。引物序列分别如下：ANP：上游：5’-GGG GGT AGG ATT GAC AGG AT-3’，下游：5’-CTC CAG GAG GGT ATT CAC CA-3’；β-MHC：上游：5’-CCT CGC AAT ATC AAG GGA AA-3’，下游：5’-TAC AG GTG CAT CAG CTC CAG-3’；β-肌动蛋白（β-actin）（内参基因）：上游：5’-AGA CCT TCA ACA CCC CAG-3’，下游:5’-GGG CAC AGT GTG GGT GAC-3’。反应条件：95℃、5 min；94℃、20 s，60℃、20 s，72℃、10 s；共40 个循环。以各组与β-actin的比值计算目的基因相对表达量。

1.4.4 心肌蛋白表达量检测

利用Western Blot 法检测蛋白表达量，包括MMP-2（64 kDa 和72 kDa）（Santa cruz 公司，sc-13594，稀释比1∶2000）、TIMP-2（Santa cruz公司，sc-21735，稀释比1∶5000）、TGF-β1（Santa cruz公司，sc-65378，稀释比1∶2000）、CTGF（Abcam公司，ab6992，稀释比1∶5000）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（Abcam公司，ab32575，稀释比1∶5000），内参蛋白为βactin（SANTA CRUZ公司，sc-81760，稀释比1∶5000）或3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate de⁃hydrogenase，GAPDH）（Abcam公司，ab181602，稀释比1∶10000）。心肌组织匀浆后，提取总蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取100 μg 蛋白样品在垂直电泳仪上经7.5% SDS-PAGE 分离后转移至PVDF 膜。兔抗鼠一抗4℃静置孵育过夜，二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，武汉博士德生物工程有限公司，AR1017，稀释比1∶2000）37℃孵育2 h。充分洗涤后，ECL 发光成像，利用凝胶成像系统（ChemiDoc XRS，美国）拍摄并扫描各条带灰度值。将各组与β-actin 或GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

所有数据用均数±标准差表示。SBP 随时间的变化采用重复测量方差分析，其他各参数组间比较使用单因素方差分析，若F检验具有统计学意义，则多重比较采用Newman-Keuls检验。显著性水平定为α＝0.05。统计软件使用SPSS 20.0 for Windows。

2 结果

2.1 样本量分析

在实验过程中，由于拒跑、意外死亡等原因，共剔除8只大鼠，因此最终样本量n＝52，其中WKY组（n＝15）、SHR-C 组（n＝14）、SHR-MT 组（n＝11）和SHRHT组（n＝12）。

2.2 SBP的动态变化

SBP 的动态时程变化见图1。WYK 组各时间点SBP 均低于其他3 组（P＜0.05）；SHR-MT 和SHR-HT 组SBP于第4周时开始下降（P＜0.05），随后SHR-MT组下降趋势一直持续至训练结束后（P＜0.05），而SHR-HT组则呈现双相变化特征，即第4～9 周下降（P＜0.05），第10 周开始升高并于第15 周与SHR-UT 组无显著性差异（P＞0.05），其中第13～18 周高于SHR-MT 组（P＜0.05）。

图1 SBP的动态变化

2.3 体重以及各组织质量的变化

体重以及各组织（心脏、肾上腺和胸腺）质量的变化见表2。与WKY组比较，SHR-UT组BM和TMI下降（P＜0.05），HMI、LVMI 和AMI 升高（P＜0.05）。与SHRUT 组比较，SHR-MT 组AMI 下降（P＜0.05），TMI 升高（P＜0.05）；SHR-HT 组HMI、LVMI 和AMI 增加（P＜0.05），TMI 降低（P＜0.05）。与SHR-MT 组比较，SHRHT 组HMI、LVMI 和AMI 增加（P＜0.05），TMI 降低（P＜0.05）。

表2 体重以及心脏、肾上腺和胸腺质量的变化

2.4 心脏结构与功能的变化

超声心动图结果见图2，心脏结构与功能的变化见表3。与WKY 组比较，SHR-UT 组LVEDD、LVESD 和LVEF 下降（P＜0.05），LVWT 升高（P＜0.05）。与SHRUT 组 比 较，SHR-MT 组LVEDD、LVESD、LVWT 和LVEF 升高（P＜0.05）；SHR-HT 组LVEDD 和LVESD 升高（P＜0.05），LVWT 和LVEF 下降（P＜0.05）。与SHRMT 组比较，SHR-HT 组LVEDD 升高（P＜0.05），LVWT和LVEF降低（P＜0.05）。

图2 超声心动图

表3 心脏结构与功能的变化

2.5 心肌病理组织学观察

心肌Masson 染色结果见图3，心脏CVF 的变化见图4，ColⅠ含量的变化见图5。Masson 染色结果显示，心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。WKY组心肌肌束间有极少量胶原纤维；SHR-UT 和SHR-HT 组心肌间质可见明显纤维化改变及胶原沉积，CVF和ColⅠ含量均较WKY 组显著升高（P＜0.05）；与SHR-UT 组比较，SHR-MT 组纤维化程度明显减轻，CVF 和ColⅠ含量下降（P＜0.05），SHR-HT组胶原沉积加重且CVF、ColⅠ含量进一步升高（P＜0.05）。

心肌HE 染色结果见图6，心肌细胞CSA 的变化见图7。HE染色结果显示，心肌细胞胞浆染成粉红色，细胞核呈蓝色。WKY 组心肌细胞排列规整，SHR-UT 和SHR-HT 组细胞排列紊乱，体积增大，CSA 高于WKY组（P＜0.05）；SHR-MT 组心肌细胞排列较SHR-UT 和SHR-HT 组规整，但心肌细胞肥大并未减轻，CSA 仍高于WKY组（P＜0.05）。

图3 心肌Masson染色（×400）

图4 心脏CVF的变化

图5 心脏ColⅠ含量的变化

图6 心肌HE染色（×400）

图7 心肌细胞CSA的变化

2.6 心肌胚胎基因表达的变化

心肌胚胎基因表达的变化见图8。与WKY 组比较，SHR-UT和SHR-HT组ANP和β-MHC mRNA表达量上调（P＜0.05）；与SHR-UT 组比较，SHR-MT 组ANP和β-MHC mRNA 表达量下调（P＜0.05），SHR-HT 组表达量则上调（P＜0.05）；与SHR-MT 组比较，SHR-HT 组胚胎基因表达量上调（P＜0.05）。

图8 心肌胚胎基因表达的变化

2.7 心肌MMP-2和TIMP-2蛋白表达量的变化

心肌MMP-2 蛋白表达量的变化见图9。与WKY组比较，SHR-UT 和SHR-HT 组64 kDa MMP-2 蛋白表达量下调（P＜0.05）；与SHR-UT 组比较，SHR-MT 组64 kDa MMP-2蛋白表达量上调（P＜0.05），SHR-HT组则无显著性变化（P＜0.05）；与SHR-MT 组比较，SHRHT 组64 kDa MMP-2 蛋白表达量下调（P＜0.05）。各组72 kDa MMP-2 蛋白表达量均无显著性差异（P＞0.05）。

心肌TIMP-2蛋白表达量的变化见图10。与WKY组比较，SHR-UT 和SHR-MT 组TIMP-2蛋白表达量下调（P＜0.05）；与SHR-UT组比较，SHR-MT组TIMP-2蛋白表达量无显著性变化（P＞0.05），SHR-HT 组则上调（P＜0.05）；与SHR-MT 组比较，SHR-HT 组TIMP-2 蛋白表达量上调（P＜0.05）。

64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值的变化见图11。与WKY 组比较，SHR-UT 和SHR-HT 组64 kDa MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05），SHR-MT组升高（P＜0.05）；与SHR-UT 组 比 较，SHR-MT 组64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值增加（P＜0.05），SHR-HT 组则降低（P＜0.05）；与SHR-MT 组比较，SHR-HT 组64 kDa MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05）。

图9 心肌MMP-2蛋白表达量的变化

图10 心肌TIMP-2蛋白表达量的变化

图11 64 kDa MMP-2/TIMP-2比值的变化

2.8 心肌TGF-β1、CTGF和α-SMA蛋白表达量的变化

心肌TGF-β1、CTGF 和α-SMA 蛋白表达量的变化依次见图12、图13和图14。与WKY组比较，SHR-UT、SHR-MT和SHR-HT组TGF-β1、CTGF以及SHR-UT和SHR-HT 组α-SMA 蛋白表达量上调（P＜0.05），SHRMT 组α-SMA 表达量无显著性变化（P＞0.05）；与SHRUT 组比较，SHR-MT 组TGF-β1、CTGF 和α-SMA 蛋白表达量下调（P＜0.05），SHR-HT组则无显著性变化（P＞0.05）；与SHR-MT 组比较，SHR-HT 组TGF-β1、CTGF和α-SMA蛋白表达量升高（P＜0.05）。

图12 心肌TGF-β1蛋白表达量的变化

图13 心肌CTGF蛋白表达量的变化

图14 心肌α-SMA蛋白表达量的变化

3 讨论

3.1 主要发现

本研究旨在探讨长期（18周，相当于人类10年）不同强度运动对SHR 心肌纤维化的影响及机制，结果发现：MICT 后心肌胶原含量和α-SMA表达降低，TGF-β1介导的信号途径受到抑制，MMP-2/TIMP-2 平衡得到改善，心脏发生生理性肥大的同时，胚胎基因表达下调，心功能提高，说明MICT通过降低胶原合成、促进胶原降解并抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化，改善心肌纤维化，进而延缓SHR 心脏重塑和心衰进程。然而HIIT 后胶原含量进一步增加，MMP-2/TIMP-2 稳态失衡，但TGF-β1信号通路和α-SMA表达并无显著性变化，心脏病理性肥大加剧，胚胎基因表达上调，心功能下降，提示HIIT通过抑制胶原降解（但对胶原合成无显著影响）加重心肌纤维化（反应性心肌纤维化），继而加速SHR 心脏重塑和心衰进程。因此，长期运动训练对高血压患者的心脏健康效应具有训练强度依赖性。

3.2 不同强度运动对SHR 心脏结构、功能以及心肌纤维化的影响

心脏肥大是高血压时应对过高室壁应力的代偿反应，在本研究中，与WKY 组比较，SHR-UT 组HMI、LV⁃MI 以及心肌细胞CSA 升高，超声检查发现LVEDD 和LVESD下降、LVWT增加，提示心脏表型发生向心性肥大（心肌肥大伴心腔缩窄）。伴随心脏代偿能力下降，心功能（LVEF）降低并逐步转向心衰，ANP 和β-MHC mRNA 表达量上调亦证实了这一点（胚胎基因过表达是心衰进展与预后的重要标志物[21]）。因此，高血压诱导的心脏肥大属于病理性心脏肥大，其原因是心肌细胞体积增大和胶原沉积增加共同作用所致。经过18周MICT 后，SHR-MT 组HMI、LVMI 以及心肌细胞CSA与SHR-UT组并无显著性差异，似乎说明MICT并未改善高血压性心脏肥大。然而超声检测进一步显示，LVEDD、LVESD和LVWT升高，提示心脏发生离心性肥大。由于心功能（LVEF）提高，因此，运动诱导SHR 心脏由病理性肥大向生理性肥大转变，同时心衰进程得以延缓（胚胎基因表达下调）。这与本课题组前期研究[9]、Garciarena 等[22]让SHR进行持续游泳耐力训练、施曼莉等[23]让心梗后心衰大鼠进行中等强度持续跑台运动以及针对耐力项目运动员流行病学调查[24]的结果一致。出乎意料的是，SHR-HT 组虽然在表型上同样发生离心性肥大（HMI、LVMI、LVEDD和LVESD增加），但心腔扩张同时室壁变薄（LVWT 下降），这一改变将导致室壁应力大幅增加，加之胚胎基因进一步上调，提示HIIT 加重病理性心脏肥大并加速心衰进程，这与本课题组前期[16]采用长期随意转轮运动的研究结果类似。此外，由于SHR-HT 组CSA 并无显著性变化而CVF 和Col-I含量升高，因此HIIT诱导的心脏肥大主要与胶原过度沉积有关。

心肌纤维化是高血压患者最常见的并发症，导致心脏硬度增加以及心室壁顺应性下降，进而影响心脏舒缩功能[25]，增加心肌电不均一性（heterogeneity），易引发室性心律失常，是心血管疾病患者心源性猝死的重要原因[2]。在本研究中，SHR-UT 组较WKY 组心肌ColⅠ含量增加，Masson染色结果显示心肌CVF升高，提示伴随高血压进展，心脏胶原过度沉积并最终引起心肌纤维化。调控ECM 稳态是抑制心脏病理性重塑、防治诸多心血管疾病的重要策略。经过18周运动后，SHRMT 组CVF 和ColⅠ含量较SHR-UT 组明显下降，但仍高于WKY 组，提示长期MICT 能够延缓SHR 心肌纤维化，与课题组前期研究结果一致[6，8，9]。胶原减少有利于恢复心动周期过程中异常的心肌收缩力分布以及提高心室壁顺应性[26]，进而增强心脏舒缩功能。此外，Choi等[27]的研究还发现，有氧运动可通过减少心肌胶原交联，改善增龄引起的心脏舒张障碍。因此，我们推测，MICT对胶原网络的生化组成和空间结构均具有积极作用。HIIT 对心肌纤维化的影响鲜有关注，本课题组前期研究发现，8 周HIIT 减轻SHR 心肌纤维化；而Holloway 等[17]则证实，4周HIIT未改善高盐饮食诱导的高血压大鼠心肌胶原沉积，可能与动物模型不同以及干预时间较短有关。然而令人意外的是，本研究将干预时间延长至18周后，SHR-HT组CVF和ColⅠ含量较SHR-UT 组进一步增加，说明长期HIIT 加重左室纤维化。研究显示，长期高强度剧烈运动同样可导致运动员[14]或健康大鼠[15]发生心肌纤维化，但主要存在于心房和右心室，提示健康与疾病状态下过度运动诱导的心肌纤维化可能存在部位特异性。由于本研究仅对左心室进行取材，因此HIIT 对其他心脏部位胶原沉积的影响尚未明确。

心肌纤维化表型按照有无细胞坏死和瘢痕形成分为反应性、浸润性和替代性三种类型[28]。浸润性和替代性心肌纤维化存在炎症细胞浸润、细胞坏死甚至瘢痕形成，同时伴随成纤维细胞（fibroblast）向成肌纤维细胞（myofibroblast）转化，后者胶原蛋白合成和分泌能力明显增加，且具有较强的迁移和促纤维化作用[28]。α-SMA 是成肌纤维细胞标志物，其表达量是诊断心肌纤维化类型的重要参考标准[29]。在本研究中，SHR-UT组α-SMA表达量显著上调，提示SHR发生浸润性或替代性心肌纤维化；18 周运动后，SHR-MT 组α-SMA 蛋白表达量下调，说明MICT在改善心肌纤维化的同时还能够抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化。值得注意的是，SHR-HT 组虽然CVF 和ColⅠ含量较SHR-UT 组升高，但α-SMA蛋白表达量并未进一步上调，提示高强度运动诱导的心肌纤维化类型属反应性心肌纤维化。Aschar等[30]同样发现，健康小鼠6周高强度运动后成纤维细胞数量明显升高，而成肌纤维细胞并未增加。Benito等[15]证实，长期剧烈运动诱导的大鼠心肌纤维化在停训8 周后即得到完全逆转，说明运动性心肌纤维化具有可逆性特征。由此推断，SHR-HT 组大鼠若及时停训或将运动强度降低，其心肌纤维化程度将得以缓解。由于反应性心肌纤维化仅ECM 异常增多，无细胞坏死或瘢痕形成，且可通过一定干预手段改善和逆转[28]，因此，在训练期间监测α-SMA的变化对于评价干预效果并及时调整干预策略具有指导意义。

3.3 不同强度运动对SHR心肌纤维化信号通路的影响

高血压时发生心肌纤维化的具体机制尚未完全明确，可能与MMP-2/TIMP-2 稳态平衡（司胶原降解）以及TGF-β1信号途径（司胶原合成）异常有关[2]。MMP-2合成初始是以无活性的酶原（酶前体）形式存在（72 kDa MMP-2），随后通过翻译后调控而活化（64 kDa MMP-2）[31]；TIMP-2 可与MMP-2 形成稳定复合物，阻碍酶原活化或抑制已活化的酶活性。在本研究中，与WKY 组比较，SHR-UT 组72 kDa MMP-2 蛋白表达量并无显著性差异，而64 kDa MMP-2降低，说明高血压对MMP-2酶原并无影响，但显著抑制MMP-2活性，这与黄伟等[32]以衰老大鼠为模型的研究结果类似。本研究还发现，SHR-UT 组TIMP-2 蛋白表达量较WKY 组下降，似乎暗示TIMP-2 对MMP-2 的抑制效应减弱。Yang等[33]的研究结果进一步显示，MMPs与TIMPs之间的动态平衡（用两者的比值表示）是胶原代谢的决定因素。本研究中SHR-UT 组64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值较WKY组下降，说明MMP-2活性受到TIMP-2的抑制，其降解胶原的作用降低。此外，SHR-UT组TGF-β1和CTCF 蛋白表达量升高，因此，SHR 心肌纤维化是TGF-β1过表达诱导胶原合成增加以及MMP-2/TIMP-2稳态失衡造成胶原降解减少共同作用所致。

经过18 周MICT，与SHR-UT 组比较，SHR-MT 组64 kDa MMP-2明显升高，而TIMP-2表达量无显著性变化，故64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值增加，提示TIMP-2 对MMP-2 的抑制作用得到解除，MMP-2/TIMP-2 稳态失衡改善，胶原降解增加，这与Kwak 等[34]的研究结果一致，即12 周跑台运动上调衰老大鼠MMP-2 活性。在甄洁等[35]的研究中，心梗后心衰大鼠进行10周跑台训练后虽然MMP-1和TIMP-1蛋白表达量均显著下降，但MMP-1/TIMP-1比值增加，与本研究结果类似。与此同时，SHR-MT 组TGF-β1和CTGF 表达量较SHR-UT组下调，提示MICT通过增加胶原降解并抑制其合成而改善SHR心肌纤维化。在Rossoni等[5]的研究中，老年SHR进行13周低强度（50%Vmax）跑台运动后心脏CVF 下降、MMP-2 活性增加，而TGF-β1和CTGF表达量并无显著性变化，由此认为运动对胶原合成并无影响，心肌纤维化减轻主要是胶原降解增加所致。动物年龄（老年vs.青年）、干预时间（13周vs.18周）以及运动强度（低强度vs.中等强度）等可能是不同研究结果存在差异的主要原因。然而18 周HIIT 后，与SHR-UT 组比较，SHR-HT 组64 kD MMP-2 无显著性变化而TIMP-2 显著升高，64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值下降，说明TIMP-2 对MMP-2 的抑制作用增强，MMP-2/TIMP-2 系统稳态平衡进一步破坏，胶原降解减少。然而TGF-β1和CTGF表达量与SHR-UT组并无显著性差异，提示长期HIIT 通过抑制胶原降解而加重心肌纤维化，但对胶原合成无明显影响。该结果与Benito 等[15]的研究不同，他们发现，长期大强度持续跑台运动诱导健康大鼠发生心肌纤维化，同时伴TGF-β1表达上调，可能与动物模型、运动方式和运动强度等因素有关。

3.4 对HIIT心脏效应的可能解释

值得注意的是，本课题组前期研究结果显示，4 周HIIT抑制心梗后心衰大鼠心脏重塑[18，19]，8周HIIT减轻SHR 心肌胶原沉积[9]，但我们将干预时间延长至18 周后却发现心肌纤维化程度与心脏重塑加剧。Holloway等的研究[17]证实，4周HIIT加速高盐饮食诱导的高血压大鼠心衰进程。王增喜等[36]的研究显示，6周HIIT可诱导健康大鼠暂时性病理性心脏肥大及心功能下降，10周时恢复。研究结果存在差异甚至矛盾可能与实验对象、造模方式、运动负荷以及干预时间等因素有关。结合本研究结果，我们认为，HIIT对心脏的作用可能存在一过性特征。本研究称取肾上腺和胸腺质量作为慢性应激参数，结果发现，SHR-HT 组较SHR-UT 组进一步发生肾上腺肥大和胸腺萎缩，因此HIIT 的心脏效应可采用应激学说来阐释[37]。本研究设计的训练负荷随时间推移逐渐递增，前8 周负荷较低（70%～80%Vmax、10～56 min/d、3～5 d/w），这种适宜的应激刺激引起氧化应激、炎症反应、细胞凋亡以及物质与能量代谢等基本信号转导通路轻度激活，产生的各种细胞因子亦处于生理水平，进而诱导心脏产生良性适应。然而随着运动负荷增加（后10 周：90%Vmax、56 min/d、5 d/w），运动应激超过了机体的代偿能力，加之心脏重塑依然在隐匿中进行，上述信号途径持续激活并产生过量（病理水平）有害因子（如氧自由基、促炎症因子、促凋亡因子等），因此心脏逐渐发生适应不良。训练期间SHR-HT组SBP的动态变化呈现双相反应特征（先下降后升高）也间接印证了上述推断。此外，高强度运动还可经由心理应激造成肠道菌群紊乱[38]，而后者是高血压发生发展的原因之一[39]，故推测HIIT 尚能够通过诱导肠道菌群失衡加重SHR心脏重塑。

4 结论

长期运动训练对高血压的心脏健康效应具有训练强度依赖性，其机制与TGF-β1介导的信号途径、MMP-2/TIMP-2稳态平衡对不同强度训练的适应存在差异有关，其中MICT通过降低胶原合成并促进其降解以及抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化改善心肌纤维化，进而延缓SHR心脏重塑和心衰进程，而长期HIIT则通过抑制胶原降解（但对胶原合成无显著影响）加重心肌纤维化（反应性心肌纤维化），继而加速SHR 心脏重塑和心衰进程。因此，目前MICT仍然是高血压患者运动康复的最佳方式，HIIT并非适用于任何人群（心血管疾病患者更应持谨慎态度），其安全性和有效性尚待进一步证实。