毛干DNA提取中四种细菌清除方法的比较研究

周永恒 马 跃，2 崔靓玉 徐艳春，2，3 杨淑慧*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.国家林业和草原局野生动植物检测中心，哈尔滨，150040；3.国家林业和草原局野生动物保护与利用工程技术研究中心，哈尔滨，150040)

毛发是一种最常见、易存储、抗污染能力强的生物材料[1-2]，含有多态性蛋白质、激素和DNA等，可以提供动物个体的生物学信息[3-5]。其中DNA所能够提供的遗传信息最为丰富，不仅用于物种鉴定，还可用来推断系统发育关系、分析种群遗传结构、追溯个体间的血缘关系等[6-7]。但是这些信息的挖掘潜力受限于DNA的质和量，DNA质量越低实验分析越困难。

毛发与其他组织一样，具有核DNA(nuDNA)和线粒体DNA(mtDNA)。毛干形成后期主要是细胞的角化，这一过程伴随着nuDNA的降解，除了角蛋白合成有关的基因以外，其他的部分逐渐断裂、降解、消失[5]。最后存留的DNA片段很小，而且含量极低。mtDNA的拷贝数是nuDNA的数百倍，且处于细胞质的线粒体中，保存的机会较高[5]。因此，通常情况下，可以从毛干角化组织中获得足够的mtDNA用于PCR扩增[8]，而nuDNA则非常困难。虽然经过大量尝试，对于nuDNA上遗传标记的分析仍然达不到稳定、可靠，除了PCR扩增成功率低以外，还可能出现等位基因缺失和杂峰等问题[9-12]，因此，人们普遍认为毛干中提取的DNA不能用于核遗传标记的分析。

我们前期研究中发现，造成这种情况的主要原因还是在于提取效率低下。我们改进了提取方法，从毛干中得到的DNA可用于微卫星等核基因的分析(另文报道)，但是无法用于基因组的测序。主要原因是毛干DNA中混有大量的细菌DNA，其数量远远超过动物DNA。这些细菌DNA主要来自毛发表面和经断裂处进入髓质的环境细菌。只要有效去除细菌DNA，有效富集动物DNA，就可以在高通量测序中获得足够的动物序列。

去除细菌DNA可以有两种途径：一是把毛发在提取DNA之前彻底清洗，去除细菌；二是在获得DNA之后，把细菌DNA分离出去。第二种途径通常采用甲基化抗体包被的磁珠，特异性地吸附甲基化丰富的动物DNA，而不吸附甲基化缺乏的细菌DNA，从而达到分离目的。但是这一方法一方面费用十分昂贵，另一方面，操作过程涉及多次移液，会损失大量的动物DNA。因此，清除细菌是最为便捷、便宜的途径。目前清洗毛发的方法有很多，一般常用的方法是用加酶洗衣粉溶液浸泡、冲洗毛发，然后以无菌水漂洗，再用70%—75%的酒精浸泡[13]。洗衣粉溶液也可以用日用洗发水溶液替代。但这些方法清除细菌不彻底，黏附于鳞片内侧和进入毛干内部的细菌无法清除。

我们建立了一种清洗毛发的方法，能够高效、快速地去除毛干上的细菌，且对下游DNA的提取影响不大。这种方法采用常规试剂和仪器，成本低廉，便于推广应用。

1 材料与方法

1.1 毛发样品及其预处理

实验前将所有的剪刀、刀片、镊子、玻璃器皿等先清洗干净，用高压灭菌锅灭菌，放入烘箱中60 ℃烘干备用。取1张常温、常湿下保存的蓝狐(北极狐，Vulpeslagopus)生皮，在皮张背部用打毛剪从根部剪取毛发约2 g放入烧杯中，加入1%的洗衣粉溶液(雕牌含酶洗衣粉)100 mL，用无菌玻璃棒搅拌2 min，转移到新的无菌烧杯中，加入无菌去离子水清洗2遍。移入75%的酒精中浸泡10 min，放到无菌的培养皿中，超净工作台上将水分自然蒸干(也可以用鼓风式烘箱加速水分蒸发)。用铝箔纸密封，室温保存备用。

1.2 细菌的清洗

用CP513型电子天平(OHAUS，美国)称15份毛发样品，每份7 mg，分别移入15个无菌的1.5 mL离心管中。本实验使用4种不同的处理方法来处理毛发样本，每种处理方法做3个重复，标记为I(I#1、I#2、I#3)—IV(IV#1、IV#2、IV#3)，最后一组V(V#1、V#2、V#3)作为对照组，清洗之后未加处理。毛干操作步骤如下。

1.2.1 取500 μL SDS溶液(10%)和500 μL NaOH溶液(4 mol/L)加入试管I中，短暂震荡30 s，室温放置15 min，小心移去液体，加入1 000 μL无菌去离子水，震荡30 s，移去液体，重复漂洗1次，移去液体。把毛干移入新的试管，加入1 000 μL 95%的乙醇保存备用。

1.2.2 取1 000 μL溶菌酶溶液(30 mg/mL)加入试管II中，震荡30 s，随后置于37 ℃水浴锅中水浴45 min，移去液体，用1 000 μL无菌去离子水漂洗2遍，再加入1 000 μL 1%的SDS溶液，置于99 ℃水浴中孵育15 min，取出后移除液体，加入无菌的去离子水漂洗2遍，去除液体。向试管III中加入1 000 μL 1%的triton X-100[14]，将试管III置于99 ℃水浴中孵育15 min，取出后移除液体，加入无菌的去离子水漂洗2遍，去除液体，移入新管，以95%乙醇浸泡保存备用。

1.2.3 向试管IV中加入1 000 μL的1.5%SDS溶液，短暂震荡30 s，置于65 ℃水浴中40 min，移去液体，随后将毛干放入装有65 ℃ 4 mol/L的NaOH溶液的试管中，用镊子夹住毛发，上下摆动，20 s后，迅速拿出，用去离子水冲洗3遍。移入新管，以95%乙醇浸泡保存备用。

为了进一步验证NaOH溶液处理的有效性，增加两组实验，将处理时间从20 s延长到35 s和50 s，其他处理过程不变，样本分别标记为IV(IV#135、IV#235、IV#335)，IV(IV#150、IV#250、IV#350)。

1.3 DNA的提取

在超净工作台内，将毛发样品取出室温下放置5 min以上，使乙醇自然挥发。转至1.5 mL的无菌离心管内，按原样编号。用剪刀把样品剪碎，每个试管中加入400 μL TNE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH=8)、45 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、45 μL DTT(0.15 mol/L)和35 μL SDS(10%)，稍微震荡混匀，56 ℃水浴中消化4 h后，再加入30 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，继续消化3 h，随后使用动植物基因组磁珠法提取试剂盒(中科雷鸣，中国北京)进行提取，具体操作步骤见说明书。

1.4 提取DNA的验证

为了确定提取成功，以蓝狐mtDNA上一个142 bp的片段和细菌pDNA上一个187 bp的片段为标记，分别进行PCR扩增。pDNA扩增引物Np为F：5′-CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC-3′，R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGACTTC-3′；mtDNA片段扩增引物Nmt为F：5′-CACGTCGTATACCAACGCCT-3′，R：5′-GG- GTTGTCCTAGGAGTGCAAA-3′；2对引物的Tm均为56 ℃，可采取同样的扩增体系和扩增程序。

扩增反应在10 μL体系中进行，PCR反应体系含有2×RapidTaqMaster Mix(南京维诺赞生物科技有限公司)5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，DNA模板2 μL，去离子水2.4 μL。混匀后瞬时离心，用9700型PCR扩增仪(GeneAmp，美国)进行扩增。扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸5 min。采用同样的扩增体系和扩增程序。

从2个扩增反应中各取1.5 μL的扩增产物进行混合，在1.5%琼脂糖胶进行电泳分离，电泳缓冲液为1×TAE，100 V下电泳22 min。

1.5 动物DNA和细菌DNA丰度的变化

为了检测不同处理方法对细菌清除的效果，以动物的mtDNA和细菌的质粒DNA(pDNA)为目标，通过相对荧光定量PCR方法分别测定相对Ct值。mtDNA的扩增引物(Nmt)和pDNA的扩增引物(Np)仍采用前述引物。为了提高扩增的特异性，将Tm都提升到60 ℃。二者的扩增体系和扩增条件相同。

PCR扩增体系为10 μL，包括1 μL DNA溶液、5 μL TB Green Premix ExTaqII(Takara，大连)，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL和3.2 μL去离子水。扩增条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；循环结束后72 ℃延伸10 s。反应用CFX384 Real-Time System 荧光定量仪(BIO-RAD，美国)完成，在每一个循环延伸步骤结束后立即收集荧光信号并显示结果。

用mtDNA的Ct值(Ctm)与细菌pDNA的Ct值(Ctb)的比值及它们Ct值的变化情况作为衡量细菌清除效果的标准，比值越低，pDNA的Ct值升高的越多，说明细菌的pDNA拷贝数越少，处理效果越好。

2 结果

2.1 DNA提取效果的定性检验

为了验证上述实验中已经成功获得了毛干DNA，以提取的DNA溶液作为模板，扩增蓝狐mtDNA上142 bp的片段和细菌pDNA上187 bp的片段。如图1，所有的处理都可以同时扩增出2个目的片段，说明这些处理中都成功提取到DNA，但都没有把细菌完全消除干净。泳道5上除了2条目的片段之外，还在下面出现了明显的引物二聚体，而且目的片段的信号强度比前几个泳道有所降低，尤其是细菌pDNA的片段信号衰减相对明显，说明所提取的DNA总量有所减小，细菌DNA的量减少更明显。

2.2 不同处理方法对细菌清除效果的定量检测

引物Nmt和Np的熔解曲线如图2所示，它们的熔点峰值分别为82.5 ℃和87 ℃左右，熔解曲线峰值点高度重合，且仅有1个峰值点，说明引物无二聚体，无非特异性扩增及其他外源DNA污染，引物设计完全符合实验要求，保证实验结果的真实性。

图1 蓝狐毛干在4种方法处理下mtDNA和细菌pDNA的扩增产物的电泳图Fig.1 Electrophoretic gram of amplicons of mtDNA and bacterial pDNA using DNA extracted from blue fox hair shaft cleaned with 4 different methods 注：M为DL2000 DNA marker；泳道1—3为样本I#1—III#1；泳道4为对照样本V#1；泳道5为样本IV#1在65 ℃的4 mol/L NaOH中保留20 s Note：M is DL2000 DNA marker.Lane 1-3 are sample I#1-I#3.Lane 4 is control sample V#1.Lane 5 is sample IV#1 treated 4 mol/L NaOH at 65 ℃ for 20 s

图2 引物Np和Nmt的熔解曲线Fig.2 Melt curves of primers Np and Nmt

采用荧光定量PCR检测发现，未经处理的毛干(V#1—V#3样本)中提取的总DNA中，mtDNA与细菌pDNA的Ct值分别是(15.53±0.15)、(16.82±0.03)，其比值为(0.923±0.009)。以这一比值为基准评估不同方法清洗后质粒DNA的数量变化。结果显示，在常温下经过SDS和NaOH双重处理、溶菌酶处理以及Triton X-100处理，I—III样品中mtDNA的Ct值分别为(17.86±0.42)、(16.15±0.48)和(16.23±0.45)；pDNA的Ct值为(16.98±0.10)、(17.02±0.18)和(17.14±0.14)。mtDNA与pDNA的Ct值之比均接近对照组的水平，分别为(1.052±0.026)、(0.949±0.037)和(0.947±0.033)。这表明这3种处理方法都未能有效洗脱毛发上的细菌。当把样品在65 ℃的NaOH中保留20 s，mtDNA和pDNA的Ct值分别为(23.653±0.036)和分别为(26.6±0.345)，二者之间的比值为(0.889±0.01)，pDNA的Ct值有明显变化，平均提高了(9.8±0.395)，说明这一处理方法使细菌DNA的拷贝数明显下降，而mtDNA的相对比例也有所提高，二者的差异扩大了近10倍。

为了进一步验证NaOH溶液中处理的时间对细菌DNA清除效果的影响，在20 s的基础上，分别延长到35 s和50 s，其他实验步骤不变。结果显示，当处理时间延长到35 s时，其中一个样本(IV#135)的mtDNA和pDNA均无数值显示，另外两组(IV#235，IV#335)的mtDNA的Ct值分别达到25.53和26.45，pDNA的Ct值分别为28.50和30.22，较处理20 s相比，分别提升了(2.33±0.42)和(2.85±0.43)，这说明将温度提升到35 ℃时，此方法对细菌DNA和mtDNA的影响基本相一致，还可能导致提取失败。当处理时间延长到50 s时，在DNA洗脱过程中，磁珠由原来的分散状态转变为凝聚状态，反复震荡也无法分散，使后续步骤无法进行。所以，就目前的方案而言，最佳处理时间为20 s左右即可。

图3 4种处理方法(I—IV)与对照组(V)mtDNA和pDNA的Ct值的比较Fig.3 Comparison of the Ct values of mtDNA and pDNA among the four cleaning methods and the control group

3 讨论

由于毛干具有稳定的化学结构、取材便利及易保存等特点[7]，人们将其视为获取动物DNA的重要来源。很多文献报道使用从毛干中提取的DNA做PCR扩增时，实验结果大都不尽人意，尤其是nuDNA扩增的成功率极低。虽然人们从提取方法、扩增条件等方面进行优化，但也难以获得有效提升[9，15]。

本研究首先评估了毛发经过普通清洗后(样本V)，获得的总DNA可以同时扩增出mtDNA和细菌pDNA的目的片段，显示二者同时存在(图1)。荧光定量PCR的检测显示，mtDNA和pDNA的Ct均值分别为(15.53±0.15)和(16.82±0.03)，二者的比值为(0.923±0.009)。说明细菌DNA的数量与动物的mtDNA相差不多。因为nuDNA比mtDNA低至少3个数量级[16]，所以如果细菌DNA在总DNA中占优势，nuDNA的扩增效率就会受到显著影响。因此在DNA提取之前清除细菌是非常必要的。

我们以样本V为基准测试了4种处理方案的效果。方案I中采用去垢剂SDS和NaOH处理，期望通过阴离子表面活性剂和NaOH共同对细菌进行裂解，但是pDNA和mtDNA的拷贝数并未发生差分。方案II中采用溶菌酶来裂解细菌，达到消除的目的。但是虽经长时间的作用(45 min)，也没有把pDNA和mtDNA的拷贝数进行有效差分，说明溶菌酶的作用效率不高。方案III中采用了非离子表面活性剂triton X-100提高体系的浸润性和细菌的洗脱效果，但也没有获得满意的效果。方案IV中采用了热的高浓度NaOH(65 ℃，4 mol/L)短时间作用(20 s)，达到了2种DNA的有效差分，pDNA的拷贝数下降了3个数量级而使动物DNA成为优势(图3)。

以上结果说明，第一，细菌对毛干的黏附力很强，采用洗衣粉溶液、阴离子去垢剂和碱液等一般的方法无法彻底清除；第二，细菌的裂解比较困难，溶菌酶等温和条件不能达到满意效果，只有通过热的强碱溶液才能裂解，并从毛干上脱落下来。

然而，延长强碱的处理时间(从20 s延长到35 s和50 s)未能获得更好的效果，相反，还严重影响了DNA提取效率，甚至引发了磁珠的凝聚。推测可能有两个原因，一是在较高温度下延长作用时间之后，强碱破坏了毛干结构并进入毛干，裂解了残存的DNA；二是强碱进入毛干后，在下游的漂洗步骤中不能有效漂洗出来，强碱被带入磁珠捕获步骤，改变了磁珠表面性质，引发凝集。

综上所述，采用热的强碱溶液可以有效清除毛干上的细菌DNA，65 ℃时最佳处理时间在20 s左右。虽然未对温度进行梯度测试，但也不推荐使用65 ℃以上的高温，避免强碱对毛干和DNA的降解作用过于激烈。另外，本研究仅测试了蓝狐的毛干，包括针毛和绒毛。但是，哺乳动物毛发结构和化学组成大同小异，应该具有普遍意义。而鹿科(Cervidae)动物的毛干属于薄壁中空的结构，承受强碱作用的能力较低，作用时间可能更要缩短，需要另行摸索。