桑黄、蛹虫草超临界CO2萃取物的抗氧化活性及其黄酮和三萜含量

张 倩 孙瑞祥 王 妍 孙建尧 张 蕊 程显好 杨树德

（鲁东大学农学院，山东烟台264025）

桑黄，为多孔菌科火木层孔菌（Sanghuangporus sanghuang），含有多糖、黄酮及三萜类化合物等活性成分，是公认的具有抗肿瘤活性的大型药用真菌。其所含多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖等功效[1]；黄酮类和三萜类化合物具有抗氧化活性[2]，还有抗肿瘤、抗肝纤维化、增强免疫的作用[3]。

蛹虫草（Cordyceps militaris），又称北虫草，含有腺苷、虫草素、虫草酸、蛋白质、多糖、超氧化物歧化酶等活性成分[4]。蛹虫草的药理功效包括抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、消炎、抗心律失常等[5]。蛹虫草药理方面的研究主要围绕其多糖和核苷类衍生物展开，而对其抗氧化活性成分的研究较少。

超临界二氧化碳萃取法可在接近室温的条件萃取，具有无毒、无害、可避免热敏性物质氧化、无化学试剂残留等优点，是提取黄酮、三萜等抗氧化活性成分的最佳方法之一[6]。笔者初步测定了人工培养的桑黄菌丝体和蛹虫草子实体的超临界CO2萃取物的抗氧化活性及其黄酮、三萜含量，旨在为今后桑黄和蛹虫草的培养与产品开发提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用桑黄及蛹虫草菌株为鲁东大学食用菌教研室保存的菌种。桑黄的固体培养基为70 g大米中加90 g 水，蛹虫草的培养基为30 g 大米加30 g 油麦，再加96 g水。

桑黄菌丝体和蛹虫草子实体干燥、粉碎后过60目筛，送至南通睿智超临界科技发展有限公司进行萃取。萃取压力为 45 MPa，温度 50 ℃，CO2流量30 L/h，加适量乙醇为夹带剂，萃取时间90 min；分离釜压力为8 MPa，温度为55 ℃，获得萃取物。

1.2 试验方法

1.2.1 清除羟基自由基能力的测定

根据 Sroka.Z 和 Cisowski.W 方法[7]，略有调整。取 9 mmol/L 硫酸亚铁溶液 1 mL、9 mmol/L 水杨酸-乙醇2 mL 和各萃取物2 mL 于试管中，最后加入8.8 mmol/L 过氧化氢溶液2 mL 启动反应，于37 ℃水浴中反应1 h。以蒸馏水作为空白调零，用分光光度计于510 nm 处测定吸光度值，空白对照组用2 mL蒸馏水代替样品溶液。同时设立试剂空白管（加水杨酸而不加过氧化氢），使用与样品溶液等体积的VC（0.2 mg/mL）溶液为阳性对照。计算清除羟基能力（SA）的公式如下：

其中：A0为空白对照液吸光值，AX为样品吸光值，AY为样品溶液在试剂空白管的吸光值。

1.2.2 清除DPPH自由基能力的测定

按照Ozen.T 等方法[8]测定DPPH 自由基清除活力。取各样品溶液4 mL 与1 mL 0.004%DPPH 溶液于试管中摇匀，黑暗中静置30 min，以无水乙醇为空白调零，在517 nm 处测吸光度值，空白对照组用4 mL 无水乙醇代替样品溶液，同时设立不加DPPH的试剂空白管，以与样品溶液等体积的VC（0.2 mg/mL）溶液为阳性对照。按下式计算清除DPPH能力（SA）：

其中：A0为空白对照液吸光值，AX为样品吸光值，AY为样品溶液在试剂空白管的吸光值。

1.2.3 黄酮类化合物含量的测定

总黄酮含量的测定参考Zhuang 等（2018）的方法[9]，略有调整。准确称取桑黄萃取物0.094 g，用乙醇溶解，配制成1.88 mg/mL 样品溶液。准确称取蛹虫草子实体0.136 g 用乙醇配制成2.72 mg/mL 样品溶液。吸取芦丁（0.1 mg/mL）对照品溶液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于试管中，用乙醇稀释至5 mL，同时吸取1.5 mL 样品溶液于新试管中，用无水乙醇定容至5 mL，在上述试管中分别加入5%NaNO2溶液0.4 mL，摇匀静置6 min；加入 10% Al（NO3）3溶液 0.4 mL，摇匀后静置6 min；加入4%NaOH 溶液4 mL，用无水乙醇稀释至10 mL，摇匀后静置15 min；于510 nm 处检测吸光度值，以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。样品按照标准曲线的操作进行吸光度测定，按回归方程计算黄酮含量。

1.2.4 三萜类化合物含量的测定

总三萜含量的测定参考张倩倩等（2018）的方法[10]。分别将熊果酸标准品溶液（0.1 mg/L）0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL 置于试管中，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和1 mL高氯酸，将全部试管65 ℃水浴加热45 min 后加入0.5 mL 冰醋酸，用乙酸乙酯定容至5 mL，摇匀后室温中静置15 min，然后于550 nm 处测定吸光值。以熊果酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，以样品溶液代替标准溶液同上进行吸光度测定，按回归方程计算三萜含量。

2 结果与分析

2.1 萃取物清除羟基自由基能力

H2O2/Fe 体系中产生的·OH 氧化水杨酸会产生有色物质，若把清除·OH 的物质加入体系中，则有色物质生成会减少，降低吸光度。吸光度越低，·OH清除效果越好。两种萃取物清除·OH 的活性如表1所示，经换算可知，1 mg桑黄菌丝体超临界CO2萃取物对·OH 的清除率与0.17 mg VC 相当，1 mg 蛹虫草子实体超临界CO2萃取物对·OH 的清除率与0.28 mg VC相当。

表1 桑黄、蛹虫草超临界CO2萃取物对羟自由基的清除能力

2.2 清除DPPH自由基能力

DPPH 自由基存在单电子，在517 nm 处有一强吸收，溶于醇后显紫色。当存在自由基清除剂时，自由基清除剂与DPPH 自由基单电子配对而减少吸收值，其接受的电子数量与褪色程度有线性关联。根据表2 可推算出，1 mg 桑黄菌丝体超临界CO2萃取物清除DPPH 自由基的能力与1.57 mg VC 的能力相当，1 mg 蛹虫草子实体超临界CO2萃取物清除DPPH自由基的能力与0.12 mg VC的相当。

表2 桑黄、蛹虫草超临界CO2萃取物对DPPH自由基清除能力

2.3 萃取物中黄酮类化合物含量的测定结果

以芦丁为标准品，利用标准曲线法测定了两种超临界CO2萃取物中黄酮类物质的含量。标准曲线的回归方程为y=15.422x-0.0292（R2=0.997）。由图1可知，桑黄菌丝体、蛹虫草子实体的超临界CO2萃取物中黄酮类物质的含量较高，分别为4.67%、4.08%，两者存在显著性差异。

2.4 萃取物中三萜类化合物含量的测定结果

以熊果酸为标准品，利用标准曲线法测定了两种超临界CO2萃取物中三萜类物质的含量。标准曲线的回归方程为y=20.821x-0.0223（R2=0.989）。由图2 可知，桑黄菌丝体、蛹虫草子实体的超临界CO2萃取物中三萜类物质含量分别为34.89%、19.25%，两者存在极显著性差异。

图1 桑黄菌丝体及蛹虫草子实体超临界CO2萃取物中黄酮类物质含量

图2 桑黄菌丝体及蛹虫草子实体超临界CO2萃取物中黄酮类物质含量

3 小结与讨论

作为两种重要的药用真菌，桑黄、蛹虫草受到了很多研究人员的青睐，其活性成分的提取技术研究报道较多，但是采取超临界CO2萃取技术提取这两种真菌活性成分的研究报道不多。研究发现，两种超临界CO2萃取物中的黄酮和三萜类物质的含量明显高于前人的报道[11-12]。两种萃取物均有一定的清除羟自由基和DPPH 自由基的活性，其中，桑黄菌丝体的萃取物具有较强的清除DPPH 的活性，清除羟自由基的活性较弱。桑黄菌丝体萃取物中黄酮类化合物的含量略高于蛹虫草子实体萃取物，而三萜类化合物的含量高0.8 倍，预示三萜类化合物对清除羟自由基的活性贡献不大，而与DPPH 的清除活性相关。考虑到黄酮和三萜类化合物的组成比较复杂，不同的组分之间清除自由基的活性不同。因此，要更清晰阐明桑黄菌丝体和蛹虫草子实体的超临界CO2萃取物的抗氧化活性差异的根本原因，需要借助质谱、核磁共振仪等具有高分辨力的精密仪器来解析两种萃取物的组成成分。此外，对属于木腐菌的桑黄而言，在大米培养基中添加木质纤维素成分，对其活性成分的组成与含量可能有一定影响，这方面的工作也很有必要开展。