Cu2+改性SBA-16固定化漆酶的研究

夏 峰

(南京医科大学康达学院，江苏 连云港 222000)

酶作为一种生物大分子催化剂，具有高效、专一、温和、绿色等特点，在各个领域被广泛应用，并且被逐步提高到战略应用的高度[1-2]。虽然酶具有如此优越的性能，但游离酶的使用经常受到环境的限制，稳定性不好且不能重复使用，而将酶固定化后则可以将酶有效地从反应体系中分离出来，从而提高酶的稳定性并可多次使用[3-5]。漆酶是一种单电子氧化还原酶，含有四个铜离子且铜离子是其活性中心的重要组成部分，稳定性较好，底物专一性宽泛，在有机药物、生物传感器、废水处理等邻域被广泛应用[6-9]。作为催化剂的载体，介孔分子筛具有较大的比表面积和孔容，是一种非常有前途的固定化酶载体[10]，与SBA-15和MCM-41相比，SBA-16是一类孔道规整，具有超大笼状的 Im3m型体心立方结构材料[11]，其较厚的孔壁、高的比表面积和热稳定性，尤其是其三维孔道的连通性更有利于物料的传输及反应物及产物的扩散，使得SBA-16在催化、吸附、分离和生物大分子的固定等方面有着良好的应用前景。本文以SBA-16为载体，用铜离子对其进行改性，然后通过吸附漆酶制备了一种固定化漆酶，结果显示，Cu/SBA-16固定化漆酶的活性与Cu2+负载量呈现出一定的正相关性。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

微量天平，摇床，pH计，Biomate 3S紫外分光光度计，离心机。

1.2 试剂

漆酶，SBA-16分子筛，乙酸铜，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O， 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(简称ABTS)。

2 实验方法

2.1 Cu/SBA-16制备

称取五份0.1 g的SBA-16，分别悬浮于10 ml Cu2+浓度为10、20、30、40、50 mmol/L的乙酸铜水溶液中，室温下浸渍24 h，然后过滤，去离子水洗涤，干燥得到蓝色样品，记为Cu/SBA-16。

2.2 漆酶的固定化

将0.1 g的SBA-16或Cu/SBA-16加到10 mL系列不同浓度漆酶的0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液中，以160 r/min的转速摇晃20 h，然后离心，用磷酸盐缓冲液洗涤固体多次，直到离心液中检测不到酶活，所得固定化漆酶记为M/SBA-16和M/Cu/SBA-16。

2.3 游离酶及固定化酶活性的检测

游离酶活性的检测：取一定浓度的游离漆酶溶液与1.0 mmol/L的ABTS溶液进行等体积反应，以适当pH值的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液为反应体系，紫外分光光度计测定体系在4 min内420 nm处的吸光度变化情况，吸光度变化越大，酶的活性越高。

固定化酶活性的检测：称0.1 g上述固定化漆酶，依次加入4 mL适当pH值的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液和2 mL 1.0 mmol/L的ABTS溶液，反应3 min后，马上置于冰水浴中停止反应，然后检测上清液在420 nm处的吸光度变化情况。

3 结果与讨论

3.1 最适pH值

酶的活性与反应体系的pH值有很大关系，不同pH值体系对游离漆酶活性的影响如图1所示[12]。本实验中漆酶可以催化ABTS生成一种蓝色物质，酶的活性越高，生成的蓝色物质颜色越深，其吸光度也越大，即酶的活性与反应体系的吸光度变化成正比。从图中可以看到，随着反应的进行，不同pH值体系的吸光度值均不断增大，但其增大的速度却不相同，其中，pH值为3的反应体系的吸光度增大地最快，说明此时漆酶的活性是最高的，即游离漆酶的最适pH值为3左右。

图1 pH值对漆酶活性的影响

3.2 载酶量对固定化漆酶活性的影响

在最适pH值下配制不同浓度的漆酶溶液，然后在SBA-16上进行固定化，得到不同载酶量的M/SBA-16，然后用分光光度计检测固定化漆酶的活性，结果如图2所示，M/SBA-16的活性随着载酶量的提高先快速升高然后趋于稳定，当载酶量为96 mg/g时，M/SBA-16的活性达到较高水平，继续增大载酶量，M/SBA-16的活性变化不大，这可能是由于太多的漆酶分子堆积于SBA-16分子筛孔道内，影响了反应物质的扩散与传输。与SBA-15的负载量(48 mg/g)相比[12]，SBA-16具有三维立体孔道结构，因此其具有更高的酶负载量。

图2 载酶量对固定化漆酶活性的影响

3.3 Cu2+对固定化漆酶活性的影响

图3 Cu2+对固定化漆酶活性的影响

Cu2+作为漆酶活性中心的重要组成部分，对漆酶的活性有重要影响。在最适pH值与最佳载酶量下，本文制备了不同Cu2+含量的M/Cu/SBA-16并考察其对漆酶活性的影响。结果如图3所示，负载Cu2+后，M/Cu/SBA-16固定化漆酶的活性与Cu2+浓度呈现一定的正相关性，随着Cu2+浓度的升高，固定化漆酶的活性随之升高，但Cu2+浓度上升到一定程度后，固定化漆酶的活性不再升高，这可能是由于高浓度的Cu2+并没有有效提高Cu2+在SBA-16上的负载量，因此相应的固定化酶的活性也不再升高。

进一步研究表明，纯SBA-16载体以及当Cu2+单独负载于SBA-16上时并不会对底物ABTS有催化作用，结果如表1所示。由此可见，所制备的固定化酶M/Cu/SBA-16中，漆酶是发挥催化作用的主要因素，而Cu2+对固定化酶具有促催化作用。

表1 不同催化剂的相对活性

4 结论

SBA-16具有超大笼状的立方结构，具有较高的比表面积和热稳定性，其三维孔道的连通性更有利于物料的传输及反应物及产物的扩散，是一种性能优异的固定化酶载体。通过本文的研究，漆酶通过物理吸附法可以固定于SBA-16的孔道内，其最适pH值为3左右，最佳载酶量为96 mg/g左右。负载Cu2+后，Cu2+对固定化酶M/Cu/SBA-16具有促催化作用，且固定化漆酶的活性随着Cu2+浓度的升高而升高，但Cu2+浓度上升到一定程度后，固定化漆酶的活性不再升高。