响应面法优化小黄姜中姜辣素的提取工艺

董加宝，夏应书，岑顺友，吴亚军

(贵州黔棠姜生物科技有限公司，贵州 安顺 561200)

生姜有小种姜、大种姜、山姜等品种，药典记载药用以小种为好，习惯把小种生姜叫“小黄姜”，小黄姜切面纯黄色，味辛辣浓，肉细嫩，味香，纤维细而少。北纬27°附近是公认天然的优质小黄姜产业带。生姜中最重要的辛辣成分为姜辣素，其具有抗氧化，抑制胃黏膜损伤，保肝利胆，镇痛解热，以及抗衰老、抗肿瘤等主要药理作用[1],姜辣素也是生姜多种功能活性的主要功能因子，在医药、食品、调味品、化妆品和卫生等领域具有广阔的应用前景[2]。目前对生姜中姜辣素的提取方法主要有有机溶剂法[3]、超声辅助溶剂法[4]、微波辅助溶剂法[5]、酶辅助提取法[6]、协同辅助提取法[7]等，但尚未见有针对镇宁小黄姜中姜辣素的提取研究，为探明小黄姜中姜辣素的含量及工业化提取生产技术，本文采用响应面法优化贵州镇宁县小黄姜中的姜辣素提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小黄姜：产地安顺镇宁县(贵州黔棠姜生物科技有限公司基地种植)，洗净后于75℃条件下干燥60 min，然后切成2～3 mm薄片置于40℃烘干24 h，再经中药粉碎机粉碎后过80目筛，备用；香草醛标准品，成都市科龙化工试剂厂；95%乙醇，天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

JA1003N电子天平(上海菁海仪器有限公司)；FW177粉碎机(湖南东晟电子有限公司)；DZF-6050真空干燥箱、SHB数显三用恒温水箱(巩义市英谷高科仪器厂)；UV2800紫外可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.3 小黄姜姜辣素提取单因素试验

不同乙醇浓度对姜辣素的提取效果：精确称取小黄姜姜粉7份，按料液比1∶20g/mL分别加入体积分数为65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇溶剂，室温下振荡浸提20 min后，取浸提液过滤，测定提取率。

不同料液比对姜辣素的提取效果：精确称取小黄姜姜粉6份，按1∶10、1∶14、1∶18、1∶22、1∶26、1∶30g/mL加入80%乙醇溶剂，在室温下震荡浸提20 min，取浸提液过滤，测定提取率。

不同温度对姜辣素的提取效果：精确称取小黄姜姜粉5份，分别在20，30，40，50和60℃的温度下，加入80%乙醇，振荡浸提20 min后，取浸提液过滤，测定提取率。

不同时间对姜辣素的提取效果：精确称取小黄姜姜粉5份，振荡提取时间分别为10，15，20，25和30 min，取浸提液过滤后测定提取率。

1.4 响应面试验设计优化提取条件

以乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、提取温度(C)为自变量，以小黄姜姜辣素提取率为响应值，用Design-Expert 8.0.6软件进行三因素三水平Box-Behnken试验设计，因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.5 样品姜辣素含量的测定

参照廖钦洪的方法[3]：准确称取 0.2 g姜粉于30 mL具塞刻度试管中，加入一定浓度的乙醇，在指定的温度下，于水浴锅中浸提一定时间，冷却、定容、过滤，得到姜辣素溶液。然后参照徐丽萍[8]的测定方法，代入香草醛回归方程求出相应浓度C，按下式即可计算出姜辣素的得率：

式中：2.001—香草醛换算姜辣素的系数；C—测定的A值在回归方程中求出的香草醛浓度，μg/mL；V1—测定产品样液总体积，mL；V0—产品提取液总体积；V2—测定时吸取的样品液体积，mL；W—样品体积，mL。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂体积分数对小黄姜姜辣素提取率的影响

由图1可知，小黄姜姜辣素的提取率随着乙醇体积分数增加先上升后趋于缓慢下降，当乙醇体积浓度达到 80%时，提取率达到峰值13.28 mg/g。姜辣素主要含有姜酚类、姜烯酚类、姜酮类、姜油酮类、姜二酮类、姜二醇类物质，通常姜酚类含量最高，姜酚属于中等极性的物质，缓慢增加乙醇浓度后溶液的极性变小，更有利于姜辣素的溶出，通常情况75%乙醇对细胞的渗透力最强，生姜细胞中的色素、杂质等脂溶性成分的溶出量也会增加[9]，80%乙醇效果最好可能是生姜粉含有部分水份导致的，乙醇浓度高于80%后因其对小黄姜中的纤维等杂质的细胞的渗透力有所降低，致使提取率开始逐步下降，因此选择乙醇体积浓度80%来提取小黄姜姜辣素为宜。

图1 不同溶剂浓度对小黄姜姜辣素提取率的影响

2.2 不同料液比对小黄姜姜辣素提取率的影响

由图2可以看出料液比在1∶10～1∶18(g/mL)之间时，小黄姜姜辣素的提取率直线上升且上升幅度较大，在1∶18～1∶22(g/mL)之间上升较为平缓，1∶22(g/mL)后提取率基本处于不变状态，说明小黄姜中姜辣素基本释放完毕。综合考虑料液比选用1∶22(g/mL)为宜。

图2 不同料液比对小黄姜姜辣素提取率的影响

2.3 不同提取温度对小黄姜姜辣素提取率的影响

由图3可以看出在30～50℃姜辣素提取率有缓慢上升的趋势，但提取温度高于50℃后温度越高提取率减少幅度越大。姜辣素化学性质较为活泼，稳定性较差，容易与氧气反应，且其重要组成姜酚在高温条件下容易分解。秦天[10]的研究表明: 姜辣素在60℃会出现快速降解，而在25℃时经7.5 h后姜辣素降解都不到10%。故对小黄姜姜辣素提取宜采用不超过50℃的温度。

图3 不同提取温度对小黄姜姜辣素提取率的影响

2.4 不同提取时间对小黄姜姜辣素提取率的影响

图4 不同提取时间对小黄姜姜辣素提取率的影响

由图4可得出温度在10～20 min时小黄姜姜辣素提取率随着时间的延长而缓慢增加，但20 min以后姜辣素反而逐步下降，可能是在50℃长时间提取时姜辣素遇高温降解，故工艺上在50℃提取小黄姜姜辣素时控制时间不宜超过20 min。

2.5 响应面法优化小黄姜姜辣素的提取工艺

2.5.1 响应面试验设计与结果

由于料液比在1∶22(g/mL)时提取率基本达到稳定状态，而溶剂的浓度变化、温度的波动、提取时间的变化对小黄姜姜辣素提取率有双向影响，故选取乙醇体积分数(A)、提取时间(B)和提取温度(C)按表1对虎杖中大黄素的提取工艺进行优化，结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果

2.5.2 数据模型建立与回归分析

采用Design-Expert 8.0.6软件三因素三水平 Box-Behnken试验设计对表2数据进行二次多项式逐步回归拟合，得到回归方程为：

Y=14.01-0.017A-0.015B+0.058C- 0.06AB-0.01AC+0.21BC-0.18A2-0.022B2-0.002C2

一次项系数值的大小可以反映因素对响应值的影响程度，由回归方程可得出提取小黄姜姜辣素的主次影响因素顺序为：浸提温度>乙醇体积分数>浸提时间。

2.5.3 回归模型的方差分析

为进一步确定模型可靠性，通过软件得到的模型方差分析结果和各项系数显著性检验结果见表3。

从表3中可知，模型中p<0.01，说明此次试验采用的二次模型是十分显著的。pA、pC、pA2、pB2、pC2的值均小于0.05，说明乙醇体积分数、提取温度与三个因素的二次项均具有显著影响；而提取时间的交互项较差。失拟项p=0.0079<0.05，表明有失拟因素存在，各因素的效应关系为乙醇体积分数>提取温度>提取时间。

表3 回归模型各项方差分析

2.5.4 响应面分析

响应曲面的坡度陡峭程度说明影响因素对响应值的影响大小[11]。从3D响应面图(图5～7)可以看出各个因素对姜辣素提取得率的影响程度。图7的响应面较为陡峭，说明提取时间和浸提温度的交互作用较大，但是由表3可知在设定的提取条件范围内，三个交互作用均未达到显著性水平。

图5 乙醇体积分数和提取时间对小黄姜姜辣素提取的交互作用

图6 乙醇体积分数和提取温度对小黄姜姜辣素提取的交互作用

图7 提取时间和提取温度对小黄姜姜辣素提取的交互作用

2.5.5 提取条件的优化及验证试验

通过软件回归方程对小黄姜姜辣素的提取条件进一步优化，由软件分析得到最佳提取工艺：乙醇体积分数77.46%、提取时间15.94 min、提取温度48.24℃、料液比1∶22 (g/mL)。结合实际条件，最佳工艺选取77.5%乙醇、提取温度48℃、提取时间16 min、料液比1∶22 (g/mL)，经3次平行试验测得平均提取率为14.22 mg/g，与预测值14.2475 mg/g相近，相对误差为0.19%。采用响应面法优化虎杖中大黄素提取工艺条件是合理可行的。

3 结论

在单因素试验的基础上，采用响应面法优化小黄姜中姜辣素的提取工艺参数，得到小黄姜姜辣素的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数77.5%、提取温度48℃、提取时间16 min、料液比1∶22 (g/mL)。在此条件下小黄姜姜辣素提取得率可达14.22 mg/g。