致驴驹腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

冯培祥，杨 莉，庄桂玉，赵付伟，嵇传良，王延涛，姜桂苗

(1. 国家胶类中药工程技术研究中心 东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城 252200；2. 青岛西海岸新区农业农村局，山东 青岛 266400)

腹泻是引起驴驹死亡的最常见原因之一，造成严重的经济损失[1-2]。据报道[3-4]，在驴驹6月龄前，多达20%驴驹腹泻是由传染性病原引起的，引起驴驹腹泻病因复杂，涉及到传染源、饲养管理、营养及环境、生理条件等多方面因素。而引起驴腹泻病主要病原菌之一是大肠杆菌。大肠杆菌作为动物肠道共栖菌[5]和条件致病菌，在临床上，其引起幼畜腹泻，严重者可导致败血症的临床症状[6-7]。近年来，随着驴养殖数量增加，因腹泻问题导致幼驹发病率及死亡率不断升高，给养殖业生产造成的损失较大。2017年7月份，聊城某规模驴场暴发了驴驹腹泻病，其发病率约为31%，死亡率约为17%。笔者通过剖检、无菌采集死亡驴驹组织样品，实验室分离鉴定为大肠杆菌。通过药敏试验筛选敏感药物，为该病在临床上的选择用药提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 2018年7月份，剖检采集聊城某养驴场2头2月龄死于腹泻驴驹的肝、脾、肺、肠道等脏器，置于4 ℃ 保存，在6 h 内进行细菌接种培养。

1.1.2 主要试剂及培养基 PremixTaqTM、pMD19-T载体、DL-2 000 DNA Marker、TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，均购自宝生物工程(大连)有限公司。麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基、伊红美蓝培养基及MH培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 药物 青霉素、丁胺卡那霉素、多西环素、氧氟沙星等14种药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.4 主要设备 上海博讯恒温振荡培养箱(HPX-9272MBE)、Touch PCR基因扩增仪(960)、山东鑫科生物科技股份有限公司自动生化/药敏分析仪(XK型)、北京君意垂直电泳仪(JY300C)、上海安亭高速离心机(TGL-16G)、山东鑫科比浊仪(XK型)。

1.2 方法

1.2.1 病原的分离及特性培养 通过分区划线将驴驹肝、脾、肺及肠管病料分别接种普通琼脂、伊红美蓝、麦康凯3种平板培养基，37 ℃恒温培养箱内培养18 h 后观察菌落形态并进行革兰染色镜检。

为排查脏器是否存在病毒感染，参考文献[8]的方法，将上述脏器称重研磨，制成加入PBS的1∶5(W/V)悬液，将双抗(100×)加入，之后反复冻融 3～4次，将过滤的上清液接种至犊牛睾丸细胞，37 ℃ 培养2～3 d，细胞染色后于电镜下观察有无病变。

1.2.2 分离菌生化鉴定 参照山东鑫科生物科技股份有限公司细菌生化鉴定试剂盒(XK-24A-C)说明书进行操作，通过生化仪(XK型)进行鉴定并判读结果。

1.2.3 药敏试验 参照CLSL推荐的K-B纸片扩散法进行药敏试验[9]，观察药敏纸片周围有无抑菌圈形成，测量其直径(d)大小。将2株分离菌药敏试验设置1个平行。参考罗玲等[10]报道方法进行结果判定：d>15 mm 为高度敏感；10.1 mm

1.2.4 16S rRNA基因序列测定与系统进化分析 采用苯酚-氯仿法提取2株分离菌DNA。参考钟世勋等[11]设计16S rRNA上游引物F：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，下游引物R：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′进行PCR扩增。扩增阳性产物与pMD19-T连接，转化大肠杆菌感受态细胞，将重组阳性质粒命名为E1、E2，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

将分离菌E1、E2的16S rRNA序列通过NCBI的Blast进行同源性比对，使用DNASTAR软件从GenBank 数据库中获得其他大肠杆菌16S rRNA 序列进行多序列匹配排列(Multiple Alignments)，采用邻接法(Neighbor joining method)构建系统进化树。

2 结果

2.1 分离菌培养特征及形态观察 从腹泻驴驹肺脏及肠管内分离到E1、E2两株细菌，其他脏器均未分离到细菌。2株分离菌在普通琼脂培养基上可见表面光滑、半透明的单菌落。其在麦康凯琼脂平板上形成圆形、边缘整齐的红色单个或多个菌落。在伊红美蓝培养基长出带金属光泽、深紫黑色的圆形菌落。2株分离菌革兰染色为阴性，镜检可见其为两端钝圆的短杆菌，散在排列。

处理脏器的悬液接种犊牛睾丸细胞后，无病变出现，通过镜检未见病毒颗粒。

2.2 分离菌的生化鉴定 分离菌E1、E2的生化反应结果一致，均符合大肠杆菌生化特性。

2.3 药敏试验 测量分离菌E1、E2的抑菌圈直径结果显示，2株分离菌的药物敏感性相似，取其平均值，结果见表1。

表1 2株分离株的药物敏感性(平均值)Table 1 Drug sensitivity of 2 isolates (Average)

2.4 16S rRNA基因序列测定与系统进化分析 扩增E1、E2 16S rRNA后，在1 500 bp处出现目的条带(图1)。将E1、E2的16S rRNA基因序列与GenBank数据库进行同源性比对，其结果与大肠肝菌的16S rRNA 基因自然聚类，将分离株分别与 GenBank收录的大肠杆菌通过DNASTAR进行同源性分析，并绘制成系统进化树(图2)。结果显示，2株分离株核苷酸序列之间的同源性为98.9%，与GenBank收录的其他大肠杆菌同源性在97.6%～99.8%。系统发育树结果如图3所示，2株分离菌处于同一分支，且与牦牛源大肠杆菌JN180964.1最近，最终构成一个分支。

图1 2株分离菌16S rRNA目的基因的PCR结果Fig.1 PCR results of 16S rRNA target genes of two isolates1:阴性对照； 2:E1； 3:E2； M:DL-2 000 Marker1:Negative control; 2:E1; 3:E2; M:DL-2 000 Marker

图2 2株分离菌16S rRNA基因序列的同源性Fig.2 The homology of 16S rRNA gene sequence of two isolates

图3 分离菌16S rRNA基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of isolates

3 讨论

本试验从腹泻驴驹的肺脏和肠管内分离到2株大肠杆菌E1、E2，分离株E1、E2与大肠杆菌的同源性最高为99.8%。除采用传统细菌鉴定方法外，本试验选取了16S rRNA基因扩增测序法对未知菌落进行了鉴定。因16S rRNA基因在细菌中具备高度保守序列，具有细菌种、属特征，已被用作细菌系统发育分类的目的基因，是一种对细菌分类鉴定快速、准确的方法[12]。据高静雯等[13]报道，从患乳房炎驴的乳汁中分离鉴定出大肠杆菌，其耐药性较差，对青霉素、阿莫西林、庆大霉素等药物都敏感。据孙莹慧等[14]报道，其从腹泻驴驹脾脏组织内分离到1株大肠杆菌，对22种药物都有耐药性，仅对多黏菌素敏感，提示该养殖场大肠杆菌分离株耐药现象严重，需要在用药方面引起管理者的重视。

细菌耐药性产生原因是多方面的，除了细菌本身内在特性外，还与抗生素不合理应用有极大关系[15]。结合该驴场用药史及现场的饲养管理情况，提示该场暴发驴驹腹泻主要原因是滥用抗生素，导致大肠杆菌耐药性的产生，诱因是饲养管理较为粗放，加剧了该病的发展。因此，笔者建议驴场需从源头上查找并解决问题，严格遵守兽药用药规范，合理用药，提升饲养管理水平，做好已发病驴驹治疗与护理工作，以降低驴驹发病率与死亡率。半个月后回访，该场长告知，通过选用敏感药物丁胺卡那霉素灌服，配合肌内注射环丙沙星注射液，及时给脱水驴驹补液等处理措施，场内驴驹腹泻情况已经得到控制。1个月后电话回访，通过圈舍卫生条件的改善及选用敏感药物治疗，驴驹腹泻问题已可控，其发病率已降至7%，再未出现因腹泻导致的死驹情况。由此可见，细菌引起的驴驹腹泻问题是可控的。本试验为腹泻驴驹病因查找提供了理论依据，并为驴场腹泻驴驹筛选出了有效抗菌药物，也为该驴场疾病防治提供了参考。