11株禽腺病毒遗传变异分析

杨小蓉，王 楠，王天恺，王增福，李晓冉，潘 文，孟凡磊，马 良

(1.中牧实业股份有限公司，北京 丰台 100070；2. 农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室，北京 海淀 100095；3. 北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术研究中心，北京 海淀 100095；4. 乾元浩生物股份有限公司，北京 丰台 100070)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是无囊膜的双链DNA病毒，直径70～90 nm，核衣壳呈 20 面对称结构。禽腺病毒分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个群，是家禽和野禽常见的传染病病原之一[1-2]。其中，Ⅰ群病毒自然宿主和实验宿主广泛，不仅感染鸡，也在火鸡、鸭、鹅、鸽、鸵鸟等野生禽类中分离到该病毒，引起多种家禽或野禽的临床和病理症候群[1-3]。

FAdV外壳由240个六邻体(Hexon)、12个五邻体(Penton base)和纤维蛋白部分构成。Hexon蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白，由Hexon基因编码，大小为120 kDa，含有型、群和亚群的特异性抗原决定簇，能引发很强的中和反应[4]。目前已知FAdVⅠ群分为A、B、C、D、E 五个种，根据血清交叉中和反应又分为12 个血清型；A种包括血清1型，B种包括血清5型，C种包括血清4型和血清10型，D种包括血清2、3、9型和11型，E种包括血清6、7、8a 和 8b型[5]。各血清型 FAdV 均可感染鸡，引起不同程度的肝炎症状；感染FAdV相关的疾病主要有鸡包涵体肝炎、肌胃糜烂及心包积水综合征等[5-6]。鸡包涵体肝炎主要发生于3～5周龄鸡，以肝脏坏死和肝炎为主要特征，死亡率10%左右。肌胃糜烂以 FAdV 血清1型的鸡胚致死孤儿病毒为主要病原，以肌胃糜烂为主要特征，我国尚未有报道。心包积水综合征主要由血清型4型FAdV感染引起，剖检以心包积液或心包内胶胨状物为特征，伴肝脏坏死，病鸡表现为突然发病迅速死亡，死亡率达30%～90%。

2019年从32个养鸡场采集发病鸡只(肉鸡、蛋鸡)组织共计88份，通过SPF鸡胚传代增殖，经PCR鉴定，其中12个养鸡场共计24份为禽腺病毒阳性，场发病率为37.5%(12/32)，病料阳性率为27.27% (24/88)，共分离到11株FAdV 毒株，并在线NCBI Blast进行了Hexon基因比对分析，分别为9株 FAdV C-4、1株FAdV D-3和1株FAdV E-8b。本试验选择对11株FAdV 毒株进行基因变异分析，以期为相关研究及后续产品的研发提供基础。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2019年以来自广西、江苏、上海、云南、河北等地发病养鸡场采集的病料。

1.2 试剂材料 病毒RNA/DNA提取试剂盒、高保真DNA聚合酶等试剂，均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 病毒DNA的提取及Hexon基因PCR扩增测序 采用病毒RNA/DNA kit试剂盒进行病毒核酸的提取纯化，按照病毒RNA/DNA kit试剂盒说明书操作。根据GenBank发表的FAdV序列设计了FAdVHexon基因扩增引物。PCR反应体系：10×Buffer 5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，上下游引物各1 μL，DNA 2 μL，高保真Taq酶 1 μL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共34个循环；72 ℃ 8 min。用1%琼脂凝胶电泳对PCR扩增产物进行观察，然后对PCR阳性产物进行回收，送至北京铂尚公司进行测序。

1.4 序列拼接与分析 应用DNASTAR、ClustalX、GeneDoc等生物学软件进行FAdV基因的拼接，与GenBank收录的国内外参考毒株进行比对与分析。用于本试验分析的毒株见表1。

表1 试验中所用的FAdV参考毒株及来源Table 1 Origin of FAdV isolates used in this test

2 结果

2.1 FAdVHexon基因核苷酸序列及其推导编码的氨基酸序列同源性分析 通过应用软件分析发现，本试验获得的11个FAdVHexon高变区基因序列相互之间核苷酸相似性为66.1%～100.0%，其推导的氨基酸相似性为56.5%～100.0%，见表2。其中，GX-1907021、GX-1908029、GX-1909030、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909031和YN-1909033共9株序列基因长度均为738 nt，编码246个氨基酸；GX-1901001毒株序列基因长度均为750 nt，编码250个氨基酸；HB-1911039毒株序列基因长度均为756 nt，编码252个氨基酸。

表2 FAdV Hexon基因核苷酸及推导编码的氨基酸序列与国内外参考毒株同源性比较Table 2 Comparison of nucleotide sequences and deduced amino acid homology of Hexon gene of FAdV with reference strains

2.2 依据FAdVHexon基因推导编码的氨基酸序列绘制遗传进化树 利用MegAlign 软件对所获得的11个FAdVHexon基因和国内外具有代表性的13个毒株序列进行多序列比较，构建系统进化树(见图1)。

图1 依据Hexon基因高变区推导的氨基酸绘制进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on deduced amino acid sequence of the Hexon genes

与国内外参考毒株相比，本试验扩增得到的11个高变区基因序列属于C群、D群和E群。从进化树图谱中显示，GX-1909030、GX-1908029、GX-1907021、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909033和YN-1909031同属于以Fowl adenovirus C为代表的C群；GX-1901001属于以Fowl adenovirus D为代表的D群；HB-1911039属于以FAdV-HNQX-101017-B为代表的E群。本试验获得的11株腺病毒Hexon基因存在不同程度的变异或缺失。

9株腺病毒的Hexon基因高变区与C群代表株SDJN0105亲缘性更近，其核苷酸序列和推导编码的氨基酸与SDJN0105相似性分别为99.9%～100.0%和99.6%～100.0%；1株腺病毒的Hexon基因高变区与D群代表株Fowl adenovirus D亲缘性更近，其核苷酸序列和推导编码的氨基酸与Fowl adenovirus D相似性分别为94.7%和92.8%；1株腺病毒的Hexon基因高变区与E群代表株FAdV-HNQX-101017-B亲缘性更近，其核苷酸序列和推导编码的氨基酸与FAdV-HNQX-101017-B相似性为99.1%和99.2%。

2.3Hexon基因核苷酸序列及其推导编码的氨基酸序列的变异分析 本试验得到的GX-1909030、GX-1908029、GX-1907021、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909033和YN-1909031共9株腺病毒的Hexon基因高变区与亲缘性更近的C群代表毒株SDJN0105进行序列比对，GX-1909030株核苷酸序列在629位碱基存在A→C突变，其推导编码的氨基酸序列在210位氨基酸存在Y→S突变。

GX-1901001株与亲缘性更近的D群代表毒株Fowl adenovirus D进行序列比对，存在碱基的点突变(见图2)，其中在230～232位存在3个碱基(AGT)的缺失；GX-1901001株推导编码的氨基酸序列氨基酸缺失和突变(见表3)；HB-1911039株与亲缘性更近的E群代表毒株FAdV-HNQX-101017-B进行序列比对，存在碱基的点突变(见表4)，其推导编码的氨基酸序列在123位和127位分别存在A→G和V→M突变。

图2 GX-1901001株FAdV Hexon基因高变区与D群代表株比对分析Fig.2 Alignment of nucleotide sequences of Hexon gene region of FAdV GX-1901001 with Fowl adenovirus D·：保守的碱基;-：缺失的氨基酸·：Conserved amino acid;-：Deleted amino acid

表3 GX-1901001株Hexon基因推导编码的氨基酸的变异Table 3 Amino acid variation of Hexon gene of FAdV of GX-1901001

表4 HB-1911039株Hexon基因核苷酸序列的变异Table 4 Nucleotide sequences variation of Hexon gene of FAdV of HB-1911039

3 讨论

Hexon蛋白是FAdV的主要免疫保护性蛋白，含主要的特异性抗原决定簇和被中和抗体识别的表位，能诱导特异性的抗体产生，是FAdV分型的重要依据。

基于Hexon基因高变区核苷酸序列分析，2019年国内发生的FAdV可分为C-4、D-3和E-8b共3个型。其中，C-4型GX-1909030株与C群代表毒株SDJN0105进行序列比对，核苷酸序列在629位碱基存在A→C突变，其推导编码的氨基酸序列在210位氨基酸存在Y→S突变。D-3型GX-1901001株与D群代表毒株Fowl adenovirus D进行序列比对，分别有39个核苷酸存在点突变，而230～232位存在3个碱基(AGT)的缺失；其推导编码的氨基酸序列有18个位点存在氨基酸突变，而在77位存在氨基酸(E)缺失。E-8b型HB-1911039株与E群代表毒株FAdV-HNQX-101017-B进行序列比对，在30、66、168、368、379、444、546位碱基分别存在C→T、C→G、A→C、C→G、G→A、C→G、A→C点突变，其推导编码的氨基酸序列在123位和127位分别存在A→G和V→M氨基酸突变。目前，关于 FAdV-3型禽腺病毒的相关试验相对较少，该病毒的致病特性、适应性、所引起的临床症状等报道较少；而在本试验采集的鸡场发病情况显示，该毒株致病性较强，引起鸡群死亡率显著增加，剖检发现肝脏发黑坏死；说明FAdV-3型GX-1901001株变异和缺失可能是导致其致病性升高的原因[6-7]。

本试验获得的11株腺病毒Hexon基因存在不同程度的变异或缺失，在进化树中已形成多个小分支。由此说明目前国内养鸡场发生的FAdV在流行过程中变异较大，可能影响现有疫苗保护效力[8]。

因此，监测和分析我国FAdV的Hexon基因变异情况，为FAdV变异演化提供了有价值的基因信息数据，对于疫苗开发及制定防控策略均有重要指导意义。