弓形虫免疫小鼠对新孢子虫感染的交叉免疫保护作用

凌慧芳，潘德桐，许建海，李木子，刘 群，刘 晶

(中国农业大学动物医学院 国家动物寄生原虫实验室，北京 海淀 100193)

新孢子虫和弓形虫是2种亲缘关系非常近的顶复亚门原虫，能够感染多种温血动物，都能够造成孕畜流产和新生动物的发病和死亡。它们在形态学和基因组学上展现了很大程度的相似性[1]，但也有关于系统发育树、分子学和生物学的研究认为，它们各自遵循不同的进化路线，有不同的生活周期以及不同的宿主倾向性[1]。犬是新孢子虫的终末宿主，新孢子虫对牛的危害尤为严重，是造成牛流产的最重要的病原之一[2]。猫是弓形虫的终末宿主，弓形虫主要危害猪、绵羊、山羊和人类，是一种重要的人兽共患病病原[3]。这2种原虫感染宿主范围广泛，临床上发生混合感染的情况非常普遍。Dubey等人使用新孢子虫Nc-1虫株免疫小鼠，研究其对弓形虫VEG虫株的交叉免疫保护力，发现Nc-1免疫的小鼠能够对弓形虫弱毒株提供有效保护力，但不能有效保护弓形虫强毒株的感染[4]。在实际生产中，弓形虫通常以II型或III型弱毒株感染动物，弓形虫弱毒株感染是否会对新孢子虫的再感染产生一定的保护力呢？本研究将通过小鼠免疫弓形虫弱毒株后再次感染新孢子虫的试验进行初步评价。

1 材料与方法

1.1 虫株、细胞、实验动物 新孢子虫Nc-1株，经Dubey授权，本实验室传代及保存；弓形虫RH株(Ⅰ型)、PRU株(Ⅱ型)、VEG株(Ⅲ型)，本实验室传代及保存；Vero细胞，本实验室传代及保存；实验动物：4～5周龄BALB/c小鼠，购自北京实验动物研究中心。

1.2 主要材料试剂 弓形虫阴阳性血清、新孢子虫阴阳性血清，本实验室制备保存；DNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；TaKaRa荧光定量试剂盒，购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.3 主要仪器设备 ROCHE LightCycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR仪；BIO-RAD酶标仪；FORMASCIENTIFIC CO2培养箱；COLE-PARMER Vibra-Cell 超声波细胞破碎仪。

1.4 虫株的培养和收集 取出保存于液氮中的弓形虫和新孢子虫虫株，在37 ℃水浴锅中迅速融化后，置于DMEM培养基中洗涤离心，用2%胎牛血清的DMEM培养基重悬接种于铺满Vero细胞的培养瓶内，于37 ℃ 5%CO2的培养箱中培养。待虫体大量释放时，用细胞刮刮落细胞，26G针头的注射器反复吹打释放虫体，最后用5 μm的滤器滤过细胞碎片收集虫体并计数。

1.5 小鼠的免疫及攻虫试验 分别用弓形虫PRU和VEG虫株对小鼠免疫。首免后2周进行二免，二免后1周采取腹腔注射新孢子虫Nc-1速殖子的方式对小鼠攻虫，试验分组和接种剂量见表1。观察临床症状，记录每组小鼠的死亡时间，绘制死亡曲线。每2天记录1次小鼠的体重。攻虫后30 d，采集试验小鼠血液及脑组织。

表1 免疫程序及攻虫试验Table 1 Immune procedure and challenges

1.6 抗体水平检测

1.6.1 新孢子虫和弓形虫速殖子全虫抗原制备 分别取新孢子虫与弓形虫速殖子108个，加入200 μL的PBS，经过3次反复冻融后，用冰浴超声裂解(工作时间1 min，工作2 s，间歇4 s，30%功率)30次。2 000 r/min 离心10 min，上清过滤后测定蛋白浓度，置-80 ℃冻存。

1.6.2 ELISA检测 全虫抗原蛋白包被96孔聚苯乙烯微量反应板，2 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃过夜；次日用磷酸盐缓冲液洗涤4遍；5%脱脂乳封闭1 h；洗涤(同上)；用抗体稀释液将小鼠血清进行1∶100倍稀释，同时设置阴、阳性血清对照，37 ℃ 孵育1 h；洗涤(同上)；加入羊抗鼠HRP-IgG (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h；洗涤(同上)；将显色液A液和B液1∶1混合均匀，每孔100 μL，避光显色10 min；加入终止液50 μL/孔终止显色；酶标仪读取OD450值。

1.7 脑荷虫量检测 提取107个新孢子虫速殖子的DNA，进行10倍倍比稀释，设置5个梯度；提取BALB/c小鼠脑组织DNA，测定浓度并进行10倍倍比稀释，共5个梯度，根据小鼠的28S基因和新孢子虫Nc5基因序列设计特异性Real-time PCR引物。记录不同稀释度样品的Ct值，绘制标准曲线，检测小鼠脑荷虫量。

1.8 统计方法 采用SPSS22.0统计软件One Way ANOVA分析，以P<0.05作为显著性标准，以P<0.01作为极显著标准，统计数据结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 小鼠临床表现 各组小鼠在免疫后及攻虫后均未出现明显的临床症状，被毛光滑有光泽，精神状态良好，活泼好动，对环境有好奇感，采食积极，采食量及饮水量均正常。攻虫后VEG免疫组和PRU免疫组与PBS空白对照组体重变化无明显差异，见图1。

图1 小鼠体重变化Fig.1 Changes in body weight of mice

2.2 小鼠血清抗体检测 各免疫组的小鼠在免疫阶段受到弓形虫免疫后，又经新孢子虫Nc-1攻虫，其血清中同时存在针对Nc-1以及弓形虫RH的抗体，但是各组的抗体水平较空白对照组无明显差别(P=0.128，0.543>0.05)，见表2。PBS空白对照组小鼠在免疫阶段未受到弓形虫免疫，经新孢子虫Nc-1感染后，其血清能与弓形虫全虫抗原产生交叉反应且抗体水平较高，表明新孢子虫与弓形虫之间交叉抗原的存在。

表2 小鼠血清抗体水平Table 2 Serum antibody level of mice

2.3 小鼠脑荷虫量检测 小鼠腹腔接种新孢子虫Nc-1株5×106/只，30 d后提取小鼠的脑组织DNA，Real-time PCR 检测小鼠脑组织中新孢子虫的荷虫量。PRU和VEG免疫组与未免疫组相比，小鼠脑荷虫量更低，且具有统计学差异(P=0.013，0.003<0.05，差异显著)，见图2。说明弓形虫PRU和VEG虫株感染后产生的免疫力，对新孢子虫Nc-1的再感染具有明显的保护效果。

3 讨论

本研究发现，经PRU和VEG免疫的小鼠经新孢子虫Nc-1攻虫后，其血清中可以产生高滴度的抗体，能被弓形虫RH虫株全虫抗原识别，说明弓形虫PRU虫株、VEG虫株和弓形虫强毒株RH虫株之间存在交叉抗原。空白对照组尽管未免疫弓形虫，但在新孢子虫Nc-1感染后弓形虫血清抗体也是阳性，说明新孢子虫和弓形虫之间也存在交叉抗原。以往有研究证明，弓形虫或新孢子虫的特异性抗体在酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光抗体试验(IFAT)中均存在交叉反应[5-6]，Nishikawa Y等人发现鼠源和猫源的弓形虫阳性血清均与新孢子虫可溶性抗原有交叉反应，表明新孢子虫与弓形虫存在交叉抗原[7]，弓形虫和新孢子虫保守的蛋白质和基因序列同样也证明了它们之间交叉反应表位存在的可能性[8]。

免疫组小鼠的脑荷虫量较空白组显著降低，说

图2 小鼠脑荷虫量检测Fig.2 Detection of parasite load in brain of mice*：P<0.05，两组之间差异显著；**：P<0.01，两组之间差异极显著*:P<0.05,the difference between the two groups is significant;**:P<0.01,the difference between the two groups is extremely significant

明经过PRU、VEG免疫的小鼠对新孢子虫的再感染具有一定的抵抗作用，其机制可能是由于弓形虫和新孢子虫之间交叉抗原诱导产生交叉抗体的结果，交叉抗原在寄生虫诱导机体产生免疫反应过程中充当着重要的角色，使宿主应对弓形虫和新孢子虫的感染产生相似的免疫应答反应[9]，弓形虫的预先免疫产生的免疫反应可以有效对新孢子虫的再次感染产生交叉保护力。有学者通过构建弓形虫微线体蛋白1(MIC1)、微线体蛋白3(MIC3)敲除减毒虫株对小鼠进行免疫，免疫后再用新孢子虫大剂量感染，免疫组小鼠存活率为80%，而空白对照组的小鼠存活率仅为30%，表明弓形虫减毒株的免疫对新孢子虫感染有保护作用，2种虫株之间有明显的交叉免疫保护作用[10]。

交叉免疫保护力的研究与感染模型的选择、免疫剂量、攻虫剂量和虫株毒力高低有着密切的关系，且免疫所产生的交叉免疫保护力是有限的。在本研究中弓形虫PRU、VEG虫株对Nc-1再次感染产生了一定的保护力，免疫组小鼠脑荷虫量与对照组相比显著降低，但产生的交叉免疫保护力并没有完全抑制新孢子虫形成脑包囊。我们也尝试评估新孢子虫Nc-1免疫小鼠对弓形虫强毒株RH的抵抗力，攻虫小鼠在12 d内全部死亡，表明新孢子虫的免疫对于弓形虫强毒株的感染没有产生有效的交叉免疫保护力。

对弓形虫和新孢子虫交叉免疫保护力的评估，基于2种虫株之间交叉抗原的存在，随着各种新兴技术的发展，交叉抗原的筛选方法也越发多样。应用蛋白组学的方法使用免疫印迹技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术，可发现存在于弓形虫和新孢子虫之间的多种交叉反应抗原[11]，通过大量制备抗新孢子虫的单克隆抗体，同样也可以筛选得到多种新孢子虫和弓形虫的交叉抗原[12]。其中，一种42 kDa弓形虫棒状体蛋白、核苷三磷酸水解酶(NTPase)、缓殖子特异性蛋白(BAG5)、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、核糖体蛋白(RP1)，热休克蛋白(HSP70)已被证实与新孢子虫有交叉免疫反应活性[12-15]。本实验室也发现，抗弓形虫MIC3的抗体能够与新孢子虫MIC3发生交叉反应，TgMIC3重组蛋白的免疫小鼠对弓形虫和新孢子虫的感染均有一定的保护作用，且小鼠感染弓形虫后的存活时间延长，新孢子虫脑荷虫量也显著降低[16]。

弓形虫和新孢子虫之间存在大量的交叉抗原，这些交叉抗原能够在免疫反应中产生一定程度的交叉识别。交叉抗原的发现为我们对这2种病原交叉保护力的研究提供了理论依据，同时这种交叉免疫保护力也可能成为开发疫苗的候选策略。