代谢性肝病中细胞的裂解性死亡

朱娅梅 马世武

调节性细胞死亡(RCD)与炎症性肝病有内在联系，它支配着代谢性肝病的结局[1]。随着代谢性肝病发展为炎症、纤维化和肝硬化，不同类型的细胞死亡可能并存。除了非裂解形式的细胞凋亡(apoptosis)，肝细胞死亡还会裂解性坏死(lytic cell death)，即通过细胞膜通透性和细胞成分的释放引起强烈的炎症反应，有助于免疫细胞的募集和肝星状细胞的活化。肝细胞死亡的调控是至关重要的，并为潜在治疗干预提供了新的机会。本文结合近期Gautheron等发表的综述[2]，讨论裂解性死亡的RCD作用机制与肝脏疾病的病理生理相关性，总结在代谢性肝病中肝细胞不同RCD的最新认识，以及潜在治疗应用。

一、细胞死亡分类与裂解性死亡

目前，细胞死亡分类基于功能方面的差异分为意外细胞死亡(ACD)和RCD。ACD即坏死(necrosis)，是不受控制的细胞死亡，由超过细胞调节能力的意外伤害刺激触发，涉及细胞质和细胞器迅速膨胀，即胀亡(oncrosis)，以及质膜通透和随后的损伤相关分子模式(DAMPs)的泄漏，从而导致细胞死亡发生；而RCD涉及效应分子参与的信号级联反应，具有独特的生化、形态特征和免疫学后果。RCD也可分为生理条件下的非裂解性死亡和裂解性死亡。程序性细胞死亡(PCD)即凋亡(apoptosis)，属于非裂解性死亡，不会引发炎症反应；而其余RCD模式，如坏死性凋亡(necroptosis)、细胞焦亡(pyroptosis)、铁死亡(ferroptosis)等属于裂解性细胞死亡[3-4](图1)，表现为细胞内含物的泄露，可引发炎症反应。坏死性凋亡、焦亡、铁死亡与坏死虽有一定的形态学相似性，但可通过不同的可调控机制促进肝脏疾病的进展，且在诱导肝细胞死亡中可同时共存，有共同的重叠机制，以充当“后备”死亡策略。

图1 细胞死亡方式分类

二、不同裂解性死亡的机制

(一)坏死性凋亡 Ray等[2]在1996年首次发现坏死性凋亡，它与坏死具有相似的形态学特征(早期包膜完整性破坏、细胞体积及胞内细胞器肿胀)，但其细胞死亡方式为可调控的、非caspase依赖性的PCD，即在caspase抑制的条件下，死亡受体(DRs)与配体结合，可触发坏死性凋亡[5]。凋亡和坏死性凋亡均可由细胞膜上的DRs启动，但是坏死性凋亡经历由受体相互作用蛋白(RIP)介导的中间过程，这是将坏死性凋亡与其他依赖DRs的凋亡相区别的特点。Holler等证实FAS、肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、TNF相关凋亡诱导配体受体(TRAIL-R)等经典DRs诱导因子，可在caspase-8传导失活、缺失或被抑制的特定情况下，触发RIP/MLKL参与的细胞坏死性凋亡通路,胞内RIPK1和RIPK3通过关键的RIP同型相互作用基序形成复合体；再由RIPK3调控MLKL的磷酸化，导致MLKL寡聚化并转移到质膜上形成膜孔；而RIP3的表达可增加促炎细胞因子表达，以及与炎症小体激活相关；RIP3参与能量代谢并决定细胞凋亡和死亡之间的转换。研究发现，caspase-8与RIP1和 RIP3 的交互表达可引起坏死性凋亡与凋亡的相互转化[6]。活化的 caspase-8可裂解RIP1和RIP3，促使平衡偏向凋亡；而抑制caspase-8 则有利于RIP1和RIP3复合物组装，形成坏死体 ( necrosome) ，诱导坏死性凋亡[7]。

(二)细胞焦亡 1992年，Zychlinsky等首次在志贺氏菌感染的巨噬细胞中观察到了焦亡，它是依赖于GSDMD蛋白家族成孔活性的细胞程序性炎症坏死, 在抵抗外部病原体入侵和感

知内源危险信号中发挥着不可替代的作用。焦亡由炎症小体激活caspase-1的经典途径和胞质脂多糖LPS激活caspase-4/5/11的非经典途径而诱发。经典途径始于胞质内的病原相关分子模式识别受体(PAMPs)和DAMPs识别各种外源性和内源性危险信号，并结合相应配体, 组装成炎性小体激活caspase-1和caspase-4/5/11，进一步切割GSDMD为具有成孔活性的N末端GSDMDNT片段和C末端GSDMDCT片段，GSDMDNT片段会诱导质膜成孔，引发焦亡。而活化的caspase-1促进炎症细胞因子( 如 IL-1、IL-18、IL-6 等) 、趋化因子、黏附分子等的成熟，并通过GSDMDNT在质膜中形成的孔被释放到细胞外，募集并激活更多炎症细胞，放大局部和全身的炎症反应。非经典途径依赖于LPS对caspase-4/5/11的活化，并独立于炎性小体进一步切割GSDMD 蛋白促进细胞焦亡，还可激活NIRP3炎性小体诱导caspase-1的经典途径促进细胞焦亡[2]。

(三)铁死亡 2003年，在抗肿瘤药物Erastin诱导肿瘤细胞死亡的研究中首次发现了铁死亡，它是铁依赖性，以脂质活性氧(ROS)堆积为特点的细胞死亡形式，可分为ROS的产生和执行铁死亡两个部分，涉及铁代谢途径、脂质代谢途径和Xc-/GPX4三个途径。铁死亡主要发挥肿瘤抑制功能，其形态学特征是细胞体积缩小和线粒体膜密度增加，而没有典型的凋亡或坏死表现。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)是生物膜抗过氧化损伤的主要保护机制，GPX4的直接或间接失活是诱导铁死亡的经典途径，而通过增加不稳定的铁池来诱导是非经典途径。Xc-转运蛋白系统促进细胞摄取胱氨酸以合成GSH。GSH可在GPX4的作用下还原活性氧。Dixon等发现Eaststin可破坏Xc-转运蛋白系统，GSH合成受抑制，细胞抗氧化能力降低，脂质活性氧堆积，引起细胞氧化性死亡，即铁死亡。而非经典途径中通过对铁转运相关蛋白的调控，铁的蓄积会通过Fenton反应引起羟自由基的产生加剧氧化损伤。研究发现热休克蛋白B1(HSPB1)通过抑制膜蛋白转铁蛋白受体1(TFR1)表达而降低细胞内铁离子浓度。因此，过表达HSPB1会抑制铁死亡，而血红素氧合酶1则通过增加胞内铁离子及活性氧，加速Eaststin诱导的铁死亡。而体内脂质代谢失衡，尤其是不饱和脂肪酸的蓄积代谢会影响铁死亡的灵敏性[4,8]。

(四)裂解性死亡的共性 与意外发生且不受控制的坏死不同，裂解性RCD有基因编码的复杂调控机制，均可提醒免疫系统杀伤细胞，可清除病原体(即坏死性凋亡和焦亡)或癌细胞(即铁死亡)，但长期刺激可导质过度炎症损伤机体，参与肝病进展。DAMPs(包括HMGB1、热休克蛋白、ATP和白介素)诱导长期慢性低水平的炎症是RCD的标志，可被模式识别受体识别，模式识别受体(如TLR和NLR)也被用于诱导RCD。因此，DAMPs似乎是将各RCD途径彼此连接的共同点。caspase-8在细胞死亡中有多重作用，可能是控制细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡的分子开关，并可防止组织损伤，除了在凋亡和坏死性凋亡中具有酶促作用外，还与MLKL一起调节巨噬细胞中的NLRP3炎性体活化。

三、不同代谢性肝病中的细胞裂解性死亡

(一)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一系列慢性肝病，从单纯性肝脏脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，与肥胖症和代谢综合征密切相关。由游离脂肪酸超载引起的代谢改变是肝细胞损伤的主要原因，但从单纯脂肪变性发展为NASH的机制尚未完全清楚。脂毒性、氧化应激、细胞器功能障碍和炎症反应加剧了肝细胞气球样变，并加剧肝细胞死亡，而慢性肝细胞死亡可能会触发免疫细胞募集和肝星状细胞活化、肝细胞更新和克隆增生，这是一个驱动NAFLD进展的前馈回路。尽管以前将重点放在细胞凋亡和坏死上，但近来发现坏死性凋亡和焦亡与NAFLD和NASH发病机制有关[2]。

1.坏死性凋亡：在人类NASH中，发现了肝细胞坏死性凋亡相关的RIPK3和MLKL表达增加。在疾病活动者中，坏死蛋白RIPK1和MLKL的全身释放支持该途径在临床NASH中的重要性。RIPK3和MLKL在肥胖和II型糖尿病患者内脏脂肪组织中的表达也增加，并与MLKL和代谢血清标志物相关。在糖尿病小鼠肝脏、脂肪组织和肌肉中，也检测到高水平的坏死性凋亡的核心成分。使用RIPK1抑制剂或敲除MLKL，可预防小鼠胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受；对RIPK1、RIPK3或MLKL的特异性敲除和化学抑制剂，可激活胰岛素刺激的AKT信号。在NASH实验动物模型的肝脏中，RIPK3含量也增加，并且在蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饮食喂养的小鼠中，抑制JNK可降低肝脏中的RIPK3水平，说明JNK的激活与RIPK3依赖性肝损伤和纤维化有关。RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡，还参与了脂肪肝的缺血再灌注损伤， MLKL-/-小鼠可降低肝脏中性粒细胞的浸润和炎症反应，而RIPK3-/-或RIPK3敲除对小鼠的迟发性缺血再灌注损伤有保护作用。虽然RIPK3缺乏可预防MCD饮食喂养小鼠的肝损伤、炎症和纤维化，但会加剧肝脏脂肪变性和凋亡，以及高脂肪饮食诱导的脂肪组织炎症、胰岛素抵抗和葡萄糖不耐症。然而，RIPK3-/-小鼠在高脂饮食中促进细胞凋亡的机制尚不确定，并且与先前在酒精模型中的结果相矛盾。如果肝细胞中RIPK3的缺失，不能直接决定肝细胞凋亡的增加，那么RIPK3的非实质性抗炎作用需通过条件敲除模型进一步分析。RIPK是细胞死亡的多效性调节剂，参与许多慢性疾病的发病机制，预防坏死体的形成和/或活化可能阻止NASH的疾病进展。研究发现高特异性RIPK1抑制剂RIPA-56能减轻饮食性肥胖小鼠的肝脏炎症和纤维化，同时逆转脂肪变性，抑制体重增加。同样，MLKL的药理抑制可降低NASH肝脏中新生脂肪的合成和趋化因子配体的表达。在人类NAFLD和NASH的研究中，利用坏死性凋亡的特征，以及条件基因敲除和更好地模拟与人类疾病相同程度的炎症和纤维化的模型的干预研究，应该为NAFLD中坏死性凋亡的靶向治疗相关性提供更多的方向[2]。

2.细胞焦亡：肝脏驻留库普弗细胞活化和浸润性巨噬细胞活化是NASH发病机制的显著特征。当库普弗细胞释放TNF-α，进一步加剧炎症和细胞凋亡的恶性循环，导致纤维化。但caspase-1、鼠caspase-11和人caspase-4/5等在炎症研究中也起到重要作用，这提示了在NASH向NAFLD的发展过程中有焦亡的参与。炎症性caspase的过度激活直接与人和小鼠的NAFLD发病有关，其中在焦亡过程中释放的促炎细胞因子是关键的效应分子。事实上，炎症小体下游IL-1β信号的激活，在NASH中驱动肝脏炎症和纤维化，并放大其它细胞因子的反应。炎症性caspase的另一个通用底物GSDMD是非典型炎症小体激活的下游效应器，并在炎症性caspase介导的焦亡中发挥特殊作用，具有内在焦亡诱导活性的GSDMDNT片段与NAFLD活动评分和纤维化呈正相关。Gsdmd-/-小鼠喂食MCD饮食，脂肪性肝炎显著减轻，肝脏炎症明显改善，血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平和肝甘油三酯含量降低。此外，MCD喂养后，Gsdmd-/-小鼠的肝纤维化明显减轻。有趣的是，Gsdmd-/-小鼠通过下调脂肪基因Srebp1c和诱导脂解基因，而防止脂肪变性。重要的是，即使没有MCD处理，负责细胞焦亡的GSDMDNT结构域高表达也会自发地导致肝损伤，这表明GSDMDNT诱导的细胞焦亡是脂肪性肝炎发病的重要机制[2]。

3.铁死亡：关于铁死亡在NAFLD和NASH中的潜在作用的证据很少。然而，脂质过氧化的继发产物，如丙二醛和4-羟基辛烯醛可作为NASH患者的氧化应激标记物，而维生素E可降低NASH患者的血清ALT。此外，由于代谢功能障碍而积累的游离铁会加重NASH，例如在NASH患者中观察到肝脏铁质沉着，而原发性血色素沉着症会加重NASH，如去除游离铁可改善肝脏损害和血清ALT水平。在胆碱缺乏和补充乙硫氨酸(CDE)饮食模型中，铁死亡抑制剂trolox和deriprone可抑制脂肪性肝炎发病时细胞死亡、炎性细胞浸润和炎性细胞因子的表达。NASH患者的肝磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺比率降低，在CDE喂养小鼠的肝脏中，参与焦亡途径的氧化磷脂酰乙醇胺增加，但在经过trolox治疗后能恢复正常[2]。

(二)酒精相关性肝病(ALD)和酒精性脂肪性肝炎(ASH) 在ALD相关脂肪变性的早期，可能出现凋亡；而在ASH早期出现坏死性凋亡，进而发生铁死亡，这与发生中性粒细胞炎症、内毒素血症和败血病等ASH最常见的死亡原因相一致。

1.坏死性凋亡：在人ALD及小鼠暴露酒精后，参与坏死凋亡的RIPK3被诱导表达，RIPK3介导的坏死性凋亡和中性粒细胞介导的肝脏炎症反应，也与终末期酒精性肝硬化患者的不良预后高度相关。相反，RIPK3缺乏可有效地防止洒精引起的血清肝酶异常、脂肪变性和炎症。然而，抑制RIPK1激酶活性可减轻高剂量酒精引起的肝脏炎症，但不能预防慢性酒精性脂肪变性和肝损伤，这表明酒精诱导的RIPK3介导的坏死性凋亡独立于RIPK1起作用。给予姜黄素或没食子酸治疗，可通过抑制RIPK3和RIPK1表达，以及DAMPs释放，来阻止洒精诱导的Nrf2表达下降。总的来说，在洒精诱导的肝损伤中，RIPK1、RIPK3和MLKL的作用仍有待进一步探索[2]。

2.细胞焦亡：细胞焦亡在ALD发病机理中起着重要作用。酒精摄入促进了内毒素释放，从而激活了肝细胞中的NLRP3炎性小体途径。相应的，NLRP3缺乏可改善酒精性肝脂肪变性和损伤。而在ASH患者和小鼠肝组织中，caspase-4/11分别上调。肠源性PAMPs和代谢源性DAMPs(ATP和尿酸)可引发细胞焦亡，并导致ALD患者及暴露洒精细胞，释放依赖炎性小体的细胞因子。研究还发现ASH患者肝细胞中的caspase-1被激活，酒精可通过过表达硫氧还蛋白相互作用蛋白(a-arrestin家族的成员)引起caspase-1介导的细胞焦亡，该现象可被miR-148a逆转。相反，在ASH患者或酒精喂养的动物肝脏中，miR-148a水平会被下调。肝细胞特异性释放miR-148a还可减轻酒精性肝损伤。这些数据和巨噬细胞耗竭后血清ALT活性仍然升高的事实，支持了酒精对肝细胞中NLRP3炎性体活化的直接作用。尽管NLRP3炎性小体在免疫细胞和肝星状细胞中的特定作用仍然值得讨论，但细胞焦亡能够刺激并有效维持ALD中的炎症循环[2]。

3.铁死亡：铁的超载和增加的氧化应激已在ALD中得到充分证明。脂肪特异性脂质1(lipin-1)的过表达加速铁积累，引起脂质过氧化，降低GSH和GAPDH，并加剧摄入酒精小鼠的肝脏损害，从而揭示了酒精诱导的肝损伤的潜在机制。Lipin-1是一种依赖于Mg2+的磷脂酸磷酸水解酶，参与磷脂和甘油三酯合成过程中二酰甘油的生成。然而，铁死亡信号如何参与致病过程仍有待阐明[2]。

(三)其他代谢性肝病

1.血色病(hemochromatosis)：铁超负荷疾病和遗传性疾病(如尼曼-皮克病或高雪氏病)的细胞死亡的研究不多。铁与许多人类肝脏疾病的发病机理有关，遗传性血色病是由铁引起的肝病的典型例子，铁也是其他形式慢性肝病(包括NAFLD)进展的重要因素。铁诱导的肝损伤可能会因并存的炎症而加重，炎症最终导致肝细胞死亡，并导致纤维化。遗传性血色病是由蛋白质产物限制铁吸收的基因突变引起的。因此，过量的铁会产生ROS，从而导致细胞死亡和整体氧化损伤，最终导致严重的慢性并发症，包括肝硬化。然而，铁和铁代谢在细胞死亡中的确切作用还不清楚。研究铁稳态在SLC7A11介导的铁死亡中的作用，发现铁超载在胞内和胞外都会触发铁死亡。事实上，SLC7A11基因敲除不足以在基础条件下诱发铁死亡，但由于胱氨酸摄取受损和ROS生成增加，促进了铁超载诱发的铁死亡。因此，细胞铁死亡是治疗铁过载相关疾病的潜在治疗靶标。而在血色病和其他与金属有关的肝病中，还需要探索其他裂解形式的细胞死亡[2]。

2.尼曼-匹克病(NPD)：又称鞘磷脂沉积病，属先天性糖脂代谢性疾病。C1型(NPC1)会导致溶酶体积累未酯化的胆固醇。临床上，NPC1在新生儿中表现为胆汁淤积性肝病，或表现为以小脑性共济失调和认知能力下降为特征的进行性神经退行性疾病。神经炎症和坏死性凋亡参与了病理级联反应。RIPK1活性的药理和遗传抑制延长了Npc1-/-小鼠和Npc1-/-/RIPK1激酶失活双突变小鼠的寿命。然而，寿命的增加是适度的，这表明作为单一疗法，RIPK1抑制治疗的潜力是有限的。相反，与Npc1-/-/Ripk3-/-小鼠相比，PC1-/-/Ripk3-/-小鼠的存活率没有增加。这表明虽然坏死性凋亡生在NPC1，但RIPK1的抑制作用可能与RIPK3在神经炎症和细胞因子产生中的独立作用有关。然而，证实了替代的RCD亚程序的作用，用caspase抑制剂或Bcl-2的神经元过度表达后，NPC1成纤维细胞的死亡并没有减轻，证实了替代RCD亚程序的作用。更重要的是，最近已建议对NPC1 进行坏死性凋亡抑制和与2-羟丙基-b-环糊精的联合治疗[2]。

3.高雪氏病(Gaucher's disease)：坏死性凋亡似乎在其他溶酶体贮积病的病理级联中起作用。高雪氏病是一种遗传性代谢紊乱，由葡糖脑苷脂酶基因突变引起，也是最常见的溶酶体贮积病。Gaucher病小鼠神经细胞死亡是caspase非依赖性和非凋亡性的。与此形成鲜明对比的是，RIPK3介导的坏死性凋亡与Gaucher病的病理机制有关。事实上，在Gaucher病的小鼠和患者脑中，RIPK1和RIPK3水平显著上调，但在从NPC1小鼠模型获得的脑中，RIPK1和RIPK3水平没有变化。这表明尽管脑炎症和小胶质细胞活化是许多溶酶体贮积病的共同特征，但神经炎症的途径是疾病特异性的。此外，RIPK3的失活改善了高雪氏病小鼠的临床病程，改善了存活率和运动协调性，并且对脑和肝损伤具有有益作用。RIPK3的消融导致CD68阳性库普弗细胞减少，ALT活性降低，提示肝细胞损伤也有所减轻。具有改善的药代动力学的坏死性凋亡抑制剂的开发可能为高雪氏病的替代治疗方法铺平道路，为此迫切需要创新的治疗方法。其他RCD形式的具体参与尚待确定[2]。

四、结论和展望

肝细胞死亡是代谢性肝病发展的中心所在，不同RCD模式的发现以及作用机制的明确，有助于提高对肝病的病理生理认识，从而对肝病进行靶向治疗。而基于当前的研究，在不同疾病中，细胞的裂解性死亡尚存在争议及问题，仍需进一步的探索，但细胞裂解性死亡在代谢性肝病中的作用是毋庸置疑的，且在同一疾病中以一种死亡方式为主导，多种共存的方式互相影响，使肝细胞损伤机制更加复杂；而通过对不同死亡模式通路中的特异因子靶向治疗，减少肝细胞死亡，延缓疾病的发展，给预防相关并发症带来新机会。