MALDI-TOF MS技术快速检测产KPC酶肺炎克雷伯菌的研究

田俊华， 邵平扬， 陈 蕾， 李丽娜， 陆斌斌， 顾敏燕， 彭佳媛

(嘉兴市第一医院 检验科， 浙江 嘉兴 314000)

肺炎克雷伯菌为条件致病菌，广泛存在于水、土壤等环境中，同时也容易定植在住院患者的呼吸道和肠道部位，引发患者院内获得性感染[1].近年来肺炎克雷伯菌在全球范围内广泛传播，已成为严重的公共卫生威胁之一，受到临床医生的极大关注.我国细菌耐药监测网数据显示，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的平均耐药率为7.6%，个别地区肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率达20.0%[2].肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的重要原因是菌株产生碳青霉烯酶(klebsiella pnuemoniaecarbapenemase，KPC)[3]，因此快速鉴别产KPC酶肺炎克雷伯菌是控制肺炎克雷伯菌耐药性扩散的关键环节.本文采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)检测产KPC酶肺炎克雷伯菌，该技术具有快速鉴别的优点.

1 材料与方法

1.1 菌株

从临床血液、尿液、痰液标本中分离肺炎克雷伯菌，采用美国BD公司Phoenix-100全自动鉴定药敏分析仪对菌株的各种生化反应进行鉴定，完成鉴定的肺炎克雷伯菌菌株于-80 ℃保存备用.

1.2 药敏试验

采用美国BD公司Phoenix-100全自动鉴定药敏分析仪对肺炎克雷伯菌进行药敏试验.抗菌药物包括阿米卡星、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶，头孢吡肟、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦.依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100标准判读药敏试验结果[4].以铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠埃希菌(ATCC25922)为质控菌株.

1.3 KPC检测[5]

采用改良Hodge试验检测肺炎克雷伯菌菌株产KPC的能力.将大肠埃希菌ATCC 25922菌液均匀涂布于MH平板上，在平板中心贴美罗培南纸片(10 μg/片)；取3～5个待测菌株菌落，从纸片边缘向外划直线，划线长度不小于20～25 mm，放于35 ℃培养箱培养16～20 h；若待测菌株向平板中央生长，则为产KPC酶菌株，反之为不产KPC酶菌株.以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705为阳性质控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706为阴性质控菌株.

1.4 质谱检测

将待测菌株接种于郑州人福博赛生物技术公司提供的血平板上，35 ℃培养箱中培养2 h，取适量待测菌落涂布于检测靶板，加入质谱样品处理基质溶液，严格按照厂家操作说明，采用法国生物梅里埃VITEKS质谱仪采集待测菌株的质谱峰图.仪器参数为线性正离子模式，采集区间为2 000～20 000(m/z).采用BioExplorer软件进行质谱数据分析.

1.5 统计学方法

应用SPSS22.0软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结 果

2.1 肺炎克雷伯菌的药敏试验

27株不产KPC酶肺炎克雷伯菌对阿米卡星、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶，头孢吡肟、氨曲南和哌拉西林/他唑巴坦7种药物敏感；38株产KPC酶肺炎克雷伯菌药敏结果见表1，结果显示，产KPC酶肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率为100.0%，提示产KPC酶肺炎克雷伯菌的耐药性较高.

表1 产KPC酶肺炎克雷伯菌的耐药率

2.2 产KPC酶肺炎克雷伯菌和不产KPC酶肺炎克雷伯菌的质谱检测

产KPC酶肺炎克雷伯菌的质谱图(202#菌株部分)见图1；不产KPC酶肺炎克雷伯菌的质谱图(2#菌株部分)见图2.图1和图2显示，产KPC酶肺炎克雷伯菌与不产KPC酶肺炎克雷伯菌的质谱峰位置不同.

依据38株产KPC酶肺炎克雷伯菌和27株不产KPC酶肺炎克雷伯菌的质谱图，分析不同质荷比(m/z)的质谱峰在2类肺炎克雷伯菌中出现的频率，结果见表2.

表2 产KPC酶菌株与不产KPC酶菌株的质谱峰分布频率

由表2可知，产KPC酶菌株和不产KPC酶菌株的7个质谱峰的分布频率有统计学差异(P<0.01)，这些质谱峰的质荷比(m/z)分别是2 070.27、2 183.65、2 209.78、2 225.73、8 309.74、8 369.67和8 372.50.质荷比为8 309.74处的质谱峰诊断产KPC酶肺炎克雷伯菌的敏感度为68.4%，特异性为100%；质荷比为2 209.78处的质谱峰诊断产KPC酶肺炎克雷伯菌的敏感度为84.2%，特异性为96.3%；质荷比为8 309.74 和2 209.78处的质谱峰联合诊断产KPC酶肺炎克雷伯菌的敏感度为89.5%，特异性为96.3%.

3 讨论与结论

目前临床上常用的细菌药敏试验检测方法主要有纸片法、稀释法、E-test法等.这些方法一般需要将细菌培养8～18 h，因此无法满足临床对细菌药物敏感性快速鉴定的需求，不利于及时指导临床合理用药.MALDI-TOF MS是一种新兴的软电离质谱技术，其样本制备简捷，只需1～2个细菌纯菌落，无须蛋白提纯，2～3 min即可获得检测结果.MALDI-TOF MS检测技术效率高、准确性好、成本低，被广泛应用于细菌、真菌、分枝杆菌等微生物的快速鉴定[6-7].

近年来，MALDI-TOF MS技术也被用于检测细菌的耐药性，检测原理是：与敏感菌株相比，耐药菌株MALDI-TOF MS检测图谱会出现峰值坐标位置移动、峰值缺失或增加和特定峰值强度改变，利用软件对足够数量的耐药菌株图谱进行分析，可以构建出耐药菌株质谱图谱数据库.将MALDI-TOF MS检测样本菌株得到的图谱与耐药菌株质谱图谱数据库进行比对，即可判断其耐药性或区分耐药菌株亚种[8].国外学者报道[9]，MALDI-TOF MS能够鉴别甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistance staphylococcus aureus，MRSA)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive staphylococcus aureus，MSSA).另有学者发现[10]，MRSA和MSSA在500～3 500(m/z)内存在差异，其中2个特征峰有鉴别意义，能够用于快速区分MRSA和MSSA，单个标本鉴别耗时约10 min，临床应用前景良好.本研究发现，产KPC酶肺炎克雷伯菌和不产KPC酶肺炎克雷伯菌在1 900～8 500(m/z)范围内存在多个不同质荷比的质谱峰，质荷比为8 309.74和2 209.78处的质谱峰联合诊断产KPC酶肺炎克雷伯菌的敏感度为89.5%，特异性为96.3%，提示应用MALDI-TOF MS技术可以快速检测产KPC酶肺炎克雷伯菌，这为肺炎克雷伯菌耐药性监测提供了一种快速监测的方法，值得推荐临床应用.