芝麻降压与抗氧化肽QCKH的构效关系、分子拼接及理化性质研究

芦鑫，贾聪，王瑞丹，高锦鸿，张丽霞，孙强，赵谋明，黄纪念*

1(河南省农业科学院 农副产品加工研究中心，河南 郑州，450002) 2(河南省农产品生物活性物质工程技术研究中心，河南 郑州，450002) 3(华南理工大学 轻工与食品学院，广东 广州，510640)

目前，高血压成为危害我国居民健康的常见疾病之一，我国成人高血压患者达2.45亿，高血压前期患者高达4.35亿[1]。为治疗高血压，研究者开发出抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)活性的降压药物，尽管药物有明确药效，但会引发皮疹、咳嗽、味觉障碍等副作用[2-4]。由于食源ACE抑制肽具有高安全性、高耐受性等优点，因而成为预防与治疗高血压的研究热点[5]。

研究发现，氧化应激与高血压密切相关。氧化应激通过干扰血压调节的信号通路，加剧血管内皮功能障碍[6]，攻击低密度脂蛋白导致胆固醇在血管壁沉积，促进高血压发生发展；另一方面，高血压加重血管损伤，促进细胞内自由基形成，加重氧化应激[7-8]。控制氧化应激对于缓解高血压有积极作用，因此，具有降压与抗氧化的双活性肽具有较高的研究价值。

目前，关于降压与抗氧化的双活性肽研究较少，多处于活性发现阶段，如GARCIA-MORA等[9]从扁豆蛋白水解物中发现具有降压与抗氧化的双活性肽；TANZADEHPANAH等[10]合成出具有降压与抗氧化的活性肽KDEDTEEVP和KDEDTEEVH。有关降压与抗氧化的双活性肽的构效关系与作用机制研究较少，有必要开展相关研究。

芝麻蛋白是抗氧化肽与ACE抑制肽的前体[11-12]。课题组前期从芝麻蛋白水解产生的多肽中，筛选出具有降血压与抗氧化的双活性肽QCKH。本文通过比较相似性指数分析法(comparative molecular similarity index analysis,CoMSIA)研究其降压与抗氧化活性的构效关系，并利用分子拼接分析其与人体血管紧张素蛋白转换酶(1O86)的结合位点，利用AdmetSAR和ToxinPred对其理化特性、代谢、安全性进行评价，随后开展环境稳定性研究，以期为后续结构修饰与应用提供理论参考，推动双活性肽构效关系研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-S-triazine, TPTZ)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸水合物(N-Hippuryl-His-Leu hydrate, HHL)、ACE、邻苯二甲醛(O-phthaldialdehyde, OPA)，美国Sigma-Aldrich公司；超滤膜UE003(截留分子质量3000 Da)、反渗透膜RO4，中科瑞阳膜技术有限公司；其他试剂，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL20M-Ⅱ高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；Infinite M酶标仪，瑞士Tecan集团有限公司；UV-6300双光束型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；XS205电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；LC-500型制备液相，杭州旭昱有限公司等。

1.3 试验方法

1.3.1 芝麻活性肽QCKH分离纯化与鉴定

低温芝麻饼粕采用索氏抽提脱油(溶剂为沸程30～60 ℃石油醚)后，按照袁东振等[13]方法从低温芝麻饼粕制备芝麻蛋白，参考周存山等[14]方法进行体外模拟消化，中和酶解液，冷却室温后，8 000 r/min离心30 min，取上清液采用UE003膜过滤，透过液随即利用反渗透膜RO4浓缩，采用LC-500制备液相分离并采用液质联用仪进行结构鉴定[11]，获得QCKH，其含量为0.037 2%。经蛋白质信息库检索，发现该肽段是芝麻7S globulin (ID：Q9AUD0_SESIN)中的DPELKQCKHQCKAQ 32～35的片段。

1.3.2 多肽设计与合成

为揭示QCKH的活性中心与构效关系，将该多肽分成2个区域：N端和C端，设计QC和KH，比较抗氧化与降血压活性，初步确立活性中心位置。随后在控制肽链长度的前提下，考察N末端、C末端、C端第2位氨基酸类型对活性影响，设计下面多肽SCKH、ACKH、FCKH、RCKH、ECKH、QCKR、QCKE、QCKD、QCDH、QCEH、QCED、QCIV，并固态合成(无锡亚肽公司合成)，纯度为95%。

1.3.3 构效关系建模

采用SYBYL-X软件中protein building模块将1.3.2中的多肽录入软件，多肽电荷模式采用MMFF94模拟，能量优化采用MMFF94力场的Powell共轭梯度算法(最大运算次数为10 000，能量优化终止标准0.000 5 kcal/mol Å)[11]。分别采用ACE抑制活性最高的SCKH、DPPH自由基清除能力最高的QCIV、ABTS阳离子自由基清除能力最高的QCKH为模板，C为骨架，构建CoMSIA模型，分子叠加图见图1。偏最小二乘法(partial least squares,PLS)和留一法交叉验证程序(leave-one-out cross validation,LOO)对构效模型进行评价，模型成立的标准是：交叉验证系数(Q2)>0.5，误差预测标准差(R2)>0.6[15]。

图1 QCKH及其衍生肽分子叠加图Fig.1 Structural alignment of QCKH and derived peptides

1.3.4 分子拼接

为揭示QCKH抑制ACE活性的途径，通过分子拼接软件Molecular Operating Environment 2015 (MOE 2015)分析QCKH与人体血管紧张素蛋白转换酶中氨基酸残基结合情况。从RCSB PDB网站(https://www.rcsb.org/structure/1O86)下载含有赖诺普利的人体血管紧张素蛋白转换酶的PDB文件,导入MOE 2015软件，质子化后，除去水分子，作为模板，打开MOE 2015中Dock模块，将QCKH作为配体载入，拼接方法设置为Proxy Triangle，优化设置为Rigid Receptor，得分方式选用London dG和GBV/WSA dG，从30个构型中选取5个最佳构型[16]。

1.3.5 QCKH生理活性与安全性预测

QCKH的生理活性采用AdmetSAR2.0 (http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/)预测，选取人体肠道吸收(human intestinal absorption，HIA)和人体口服生物利用度(human oral bioavailability，HOB)表征吸收特性，选取血脑屏障(blood-brain barrier penetration，BBB)、血浆蛋白结合率(plasma protein binding，PPB)、P-糖蛋白底物与抑制剂来表征分布特性，选取细胞色素450(cytochrome P450，CYP)底物与抑制活性表征代谢特性，选取致癌性和急性经口毒性表征毒性[17]。此外，对毒性及理化特性还采用ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in /raghava/toxinpred/design.php)预测，预测方法基于Swiss-Prot[18]。

1.3.6 QCKH稳定性试验

1.3.6.1 热稳定试验

将QCKH配制成2 mg/mL的测试液，分别置于30、40、50、60、70、80、90和100 ℃水浴加热3 h，冷却至室温，测定DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率、ACE抑制率。

1.3.6.2 酸、碱稳定性试验

配制2 mg/mL QCKH溶液，分别调节pH为2、4、6、8、10和12，在20 ℃静置3 h，测定其DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率、ACE抑制率。

1.3.6.3 紫外线稳定性试验

配制2.0 mg/mL的QCKH溶液，置于15 W紫外灯(257 nm)下10 cm处，室温下照射48 h，每隔4 h，测定其DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率、ACE抑制率[19]。

1.3.7 抗氧化活性测定

采用DPPH自由基和ABTS阳离子自由基自由基清除率来评价多肽抗氧化活性，参照LU等[11]的方法，测定多肽溶液的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率，利用SPSS 25中probit模块计算IC50，即自由基清除率达到50%对应的多肽浓度。

1.3.8 ACE抑制活性测定

参考LI等[20]的方法，取20 μL的多肽溶液与40 μL ACE(12.5 mU/mL)和40 μL 4.66 mmol/L HHL溶液(0.4 mmol/L pH 8.5磷酸缓冲液含0.6 mol/L NaCl)混合，在37 ℃反应1 h后，加入150 μL 1.2 mol/L NaOH溶液终止反应，再加入40 μL体积分数 2%的OPA甲醇溶液室温反应20 min，随后加入40 mL 6 mol/L HCl溶液终止反应。将反应液按体积比1∶15 加入蒸馏水稀释后，倒入荧光比色皿，设定激发波长340 nm，发射波长455 nm，狭缝宽度5 nm，测定荧光强度。按照公式(1)计算ACE抑制率：

(1)

式中：a,含有多肽、ACE和HHL溶液的荧光强度;b,ACE和HHL溶液的荧光强度;c,多肽和HHL溶液的荧光强度;d,HHL溶液的荧光强度。

测定系列多肽浓度对应的ACE抑制率采用SPSS 25中probit计算IC50，即抑制ACE活性50%时，对应的多肽浓度。

1.3.9 数据处理

无特殊说明，所有试验平行测定3次。单因素方差分析由SPSS 25(Duncan算法)运算，显著水平0.05，高度显著水平0.01。同一曲线上带有相同小写字母的数据间在0.05水平无显著差异。

2 结果与分析

2.1 QCKH构效关系

为验证上述推测，合成QC与KH并检测活性，结果显示QC与KH均有ACE抑制与抗氧化活性，这表明以上2种多肽片段均对QCKH的活性有贡献(表1)。相较于QCKH的ACE抑制活性与抗氧化活性，QC与KH的抗氧化活性均弱于QCKH，上述结果说明QC与KH结合形成QCKH的空间结构与电荷分布提升了抗氧化活性。

表1 QCKH及衍生多肽的ACE抑制与抗氧化活性Table 1 ACE-inhibitory and antioxidant activities of peptides derived from QCKH

根据Q2和R2，基于ACE抑制活性与DPPH自由基清除能力构建的QCKH的CoMSIA模型成立，而基于ABTS阳离子自由基清除能力构建的CoMSIA模型的Q2值与0.5接近，其准确性较差，故不予考虑(表2)。

表2 QCKH降压与抗氧化的CoMSIA模型Table 2 CoMSIA models for ACE-inhibitory and antioxidation of QCKH

分析结构因素对降压与抗氧化的影响发现，氢键是影响QCKH降压与抗氧化活性的首要因素，该结果与管骁等[27]研究结果部分相符。推测QCKH中氨基酸残基通过氢键与ACE的活性位点结合，改变其空间结构，造成ACE难以与人体血管紧张素1结合，起到抑制作用。同时，QCKH的氨基酸残基经氢键与自由基连接，通过共振稳定自由基结构，起到抗氧化作用[28]。电荷极性对QCKH的ACE抑制影响大于DPPH自由基清除，这可能是多肽的电荷极性会影响与ACE活性中心Zn2+结合，导致在ACE抑制活性上产生差异[29]。QCKH及其衍生肽均是4肽，分子尺寸较小，易于进入ACE与其活性位点结合，同时，由于结构简单，活性基团暴露，易于DPPH自由基结合，导致QCKH空间位阻的影响较低。

QCKH的氨基酸残基通过氢键、电荷极性、疏水作用、空间位阻对ACE抑制活性与DPPH自由基清除能力的影响见图2～图6。在图2中，氢键供体在绿色区域有利于提高ACE抑制活性与抗氧化活性，而氢键供体在红色区域不利于提高活性，由此推知，C末端氨基酸残基侧链被氢键供体基团取代可以提高ACE抑制(图2-a)，这可能是QCKH的ACE抑制活性强于QCKE的原因，QCKE中Glu4的侧链上羰基是氢键受体，QCKH中His4侧链为咪唑基是氢键供体。在N端氨基酸残基侧链顶端有氢键供体，有利于提高DPPH自由基清除能力，这与DPPH自由基中氢键受体硝基有关。通过分子间氢键，多肽能更加稳定与DPPH连接，为后续发生电子转移提供有利条件。

a-氢键供体对ACE抑制活性影响;b-氢键供体对DPPH自由基清除影响图2 CoMSIA模型中氢键供体对QCKH的活性影响Fig.2 Effect of hydrogen bond donor on activities of QCKH in CoMSIA model

在图3中，氢键受体在绿色区域有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除活性，反之，在红色区域不利于ACE抑制和DPPH自由基清除活性。C末端羧基中羰基对于提升QCKH的ACE抑制活性起到重要作用(图3-a)。

a-氢键受体对ACE抑制活性影响;b-氢键受体对 DPPH自由基清除影响图3 CoMSIA模型中氢键受体对QCKH的活性影响Fig.3 Effect of hydrogen bond acceptor on activities of QCKH in CoMSIA model

若要提高多肽的ACE抑制和DPPH自由基清除活性，绿色区域适宜带正电荷取代基，红色区域适宜带负电取代基。由图4可知，C端氨基酸的羧基被带正电基团取代会提高ACE抑制活性，推测通过阳离子-π相互作用，影响ACE中His383和Tyr523，增加抑制效果[30]。对于QCKH的抗氧化活性而言，Lys3侧链带正电荷是有利因素(图4-b)，这可能是在电荷斥力的作用下，使缺电子带正电的自由基避开上述基团，接近Cys2的巯基，加速反应进行，显示更强的抗氧化能力。QCKH的DPPH自由基清除能力强于QCDH也证实上述结论。

a-电荷极性对ACE抑制活性影响; b-电荷极性对DPPH自由基清除影响图4 CoMSIA模型中电荷极性对QCKH的活性影响Fig.4 Effect of electrostatic field on activities of QCKH in CoMSIA model

图5中，疏水基团出现在绿色区域内有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除活性，反之，在红色区域内出现会降低ACE抑制和DPPH自由基清除活性。由图5可知，N端和Lys3氨基酸残基侧链顶端含有疏水氨基酸有利于增强ACE抑制活性，这同前人报道N端为疏水性芳香氨基酸的ACE抑制肽活性较高的结论部分一致[31]。N端氨基酸残基的α-C附近区域为疏水基团有利于提升抗氧化活性，这可能是DPPH自由基为非极性自由基，当多肽N端有疏水基团时，更有利于两者通过疏水相互作用靠近，增加Cys2与DPPH反应机率。

a-疏水作用对ACE抑制活性影响;b-疏水作用对DPPH 自由基清除影响图5 CoMSIA模型中疏水作用对QCKH的活性影响Fig.5 Effect of hydrophobicity on activities of QCKH in CoMSIA model

图6中，小体积取代基出现在红色区域、大体积取代基出现在绿色区域都有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除能力。由图6-a可知，增加C端氨基酸残基体积，有利于提高ACE抑制活性。上述结论同UDENIGWE等[32]报道C端为大侧链氨基酸的ACE抑制肽有较高活性的结论一致。适当减少N端氨基酸氨基体积，更容易暴露Cys2的巯基基团，有利于提高多肽DPPH自由基清除能力(图6-b)。

a-空间位阻对ACE抑制活性影响;b-空间位阻对DPPH自由基清除影响图6 CoMSIA模型中空间位阻对QCKH的活性影响Fig.6 Effect of steric field on activities of QCKH in CoMSIA model

2.2 QCKH的分子拼接

由图7-a可知，QCKH与降血压药物赖诺普利在ACE中的位置基本吻合。由图7-b可知，QCKH通过氢键与ACE上的Tyr520、Gln281、Lys511、His513、His353、Tyr523、Ala354、Ala356和Glu411结合，通过离子键同His387、Lys511、His353和Zn701结合，还通过芳烃键与Phe457、His353发生作用。前人报道，ACE催化活性受活性口袋S1(Ala354、Glu384、Tyr523)、S2(Gln281、His353、Lys511、His513、Tyr520)、S1′(Glu162)和活性中心Zn2+(His383、His387和Glu411)的影响[33]。由此可知，QCKH主要通过影响ACE活性口袋S1、S2和Zn2+的结构实现对ACE的抑制。His4的羧基作为氢键受体同Gln281，Tyr520，Phe512，Lys511发生作用，验证了2.1构效关系分析中C端适宜由氢键受体构成的结论。

a-空间拼接图(蓝色分子为QCKH，绿色分子为赖诺普利); b-平面拼接图图7 QCKH与ACE分子拼接图Fig.7 Molecular docking for QCKH and ACE

2.3 QCKH生理活性与安全性预测

活性肽在体内产生有益功能，必须能被肌体吸收、输送与代谢，同时，还有低的毒副作用。因此，有必要评价QCKH的生理活性与安全性。由表3所示，QCKH可以经口吸收；在血液中，与血浆蛋白结合率低，这表明QCKH在血液中较稳定，有利于药效发挥；高血脑屏障、非细胞色素P450酶系底物(除CYP3A4)、无抑制细胞色素P450活性，这表明QCKH既不影响中枢神经，也不干扰正常的细胞活动；QCKH预测无致癌性与无毒性，安全性高。上述结果表明，QCKH可以作为功能因子应用于保健食品。然而，基于Lipinski类药五原则，QCKH氢键受体和可旋转键偏多，且脂水分配系数偏低，需要分子修饰以简化结构和提高脂溶性。

表3 QCKH生理活性、理化特性与安全性预测Table 3 Prediction on physiological activity, physicoch- emical properties and safety of QCKH

2.4 QCKH的环境稳定性

由图8可知，温度会显著影响QCKH的活性，其中对于抗氧化活性的影响要大于降压活性的影响。随着加热温度升高，QCKH的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力迅速下降，而降压活性下降较为平缓。产生上述变化的原因可能是QCKH的抗氧化活性主要受Cys2的影响，随着温度上升，性质活泼的巯基更易氧化脱氢，同时，还会形成分子间二硫键，从而降低抗氧化活性[34]。虽然QCKH的降压活性与巯基无关，但通过二硫键连接的二聚体，改变原有的空间结构并增加体积，从而削弱与ACE结合的能力，导致ACE抑制活性下降。

图8 温度对QCKH活性的影响Fig.8 Effect of temperature on activities of QCKH

pH对QCKH活性影响的见图9。当pH<6时，QCKH的抗氧活性无显著差异，进入碱性环境时，QCKH的抗氧化活性显著下降。这可能是一方面QCKH在碱性条件下，发生消旋，从而引起肽链构象发生改变，影响活性[35]；另一方面，QCKH中Cys2巯基发生解离，从而降低活性[36]。与抗氧化活性不同，QCKH的ACE抑制活性在pH 8达到最强，随后呈现下降趋势。这可能与QCKH的等电点有关，QCKH的等电点为8.57，在pH为8时，大部分QCKH中His羧基为负电荷，由2.2小节可知，这有利于QCKH抑制ACE活性，然而，随着pH的继续升高，Gln1的氨基失氢，不能作为氢键供体，减弱与ACE结合能力，从而降低ACE抑制活性；加之，碱性导致肽链消旋，改变空间结构，也影响ACE抑制活性。

图9 pH对QCKH的影响Fig.9 Effect of pH on activities of QCKH

紫外照射对QCKH的活性影响见图10。随着紫外照射时间延长，QCKH的ACE抑制活性与抗氧化活性均显著下降。紫外线作用导致多肽外层电子从基态跃迁到激发状态，导致羟基、巯基、氨基上的氢发生电离，从而改变原有结构，影响活性[37]。此外，紫外线照射导致水分子裂解产生羟自由基[19]，也会加速QCKH抗氧化能力的消耗，从而导致出现抗氧化活性下降大于ACE抑制活性现象。

图10 UV照射对QCKH的影响Fig.10 Effect of UV on activities of QCKH

3 结论

综上所述，QCKH的抗氧化与降血压活性与Cys2和His4有关，经CoMSIA建模发现，QCKH的抗氧化与降血压活性主要受氢键、电荷极性、疏水作用影响。QCKH通过氢键与离子键与ACE的活性口袋S1和S2、活性中心Zn2+发生作用，改变ACE空间结构，起到抑制ACE活性的作用。ADMET预测QCKH可以经口吸收，不会干扰人体正常的生理活动，安全性高。分析环境因素影响发现，在常温、中性、避光条件下，QCKH的抗氧化与降血压活性基本稳定，且在环境因素作用时，QCKH降血压活性比抗氧化活性稳定。

在后续研究中，QCKH应通过分子修饰，以达到简化结构、提高脂溶性、改善肠道吸收能力；在加工过程中，应避免高温、极端pH与光照，以减少损耗。