L-精氨酸诱导小鼠急性坏死性胰腺炎肠屏障损伤的实验研究*

黄则华 梅启享 黄春兰 陆颖影 曾 悦

上海交通大学附属第一人民医院消化科(201620)

背景：研究表明，肠屏障功能障碍与急性坏死性胰腺炎(ANP)的发生、发展密切相关。目的：探讨L-精氨酸诱导的ANP小鼠肠屏障损伤及其加重ANP的机制。方法：将30只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(SO组)和ANP组。ANP组小鼠给予腹腔注射8%L-精氨酸(4.5 g/kg)共两次，间隔为1 h；SO组则腹腔注射等体积0.9% NaCl溶液。造模24 h、48 h和72 h后处死小鼠，行HE染色评估胰腺和肠道病理学评分，检测血清淀粉酶、脂肪酶水平，以ELISA法评估炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和肠道通透性(DAO、D-乳酸、LPS)水平，蛋白质印迹法检测胰腺组织和肠道组织TLR4、MyD88蛋白表达。结果：与SO组相比，ANP组相应时间点胰腺组织和回肠组织病理学评分显著增高(P<0.05)，血清淀粉酶、脂肪酶、炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、肠道通透性指标(DAO、D-乳酸、LPS)水平均显著增高(P<0.05)，胰腺组织和回肠组织TLR4、MyD88蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论：L-精氨酸诱导的ANP小鼠肠道通透性增加，LPS释放增多，可能通过激活TLR4-MyD88信号通路促进肠道、全身炎症反应，进而加重ANP。

重度急性胰腺炎(SAP)是一种高死亡率的危重急症，其肠屏障功能障碍是促进全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能障碍综合征(MODS)等发生、发展的重要因素之一[1]。有研究表明，AP的肠屏障功能障碍可导致肠道菌群失衡移位，可反过来加重AP[2]。L-精氨酸腹腔内注射是诱导小鼠ANP模型的重要方法之一，但对其肠道损伤的研究较少见。本研究通过给予小鼠腹腔内注射L-精氨酸制备ANP模型，观察其胰腺损伤和肠屏障功能障碍，旨在探讨肠屏障损伤加重ANP的机制。

材料与方法

一、实验动物与主要试剂

SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号：SCXK(沪)2012-0002]，6～8周龄，体质量20～22 g；分笼饲养，每笼5只，于22～26 ℃动物房饲养1周。实验前禁食12 h，自由饮水。实验方案通过上海交通大学医学院伦理委员会批准。L-精氨酸购于美国Sigma公司，TNF-α、IL-6、IL-1β、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸和脂多糖(LPS)ELISA试剂盒均购于上海西唐生物科技有限公司。兔抗鼠多克隆抗体Toll样受体4(TLR4)、兔抗鼠多克隆抗体髓样分化因子88(MyD88)以及兔抗鼠多克隆抗体内参Tubulin均购于美国Abcam公司。

二、研究方法

1. 模型建立和动物分组：按数字表法将小鼠随机分为假手术组(SO组)和ANP组，并进一步分为不同时间点亚组(24 h、48 h、72 h)，每组各5只。ANP组小鼠给予腹腔注射8% L-精氨酸(4.5 g/kg)2次，间隔1 h；SO组腹腔注射等体积0.9% NaCl溶液。造模结束后眼球取血，取胰腺组织和回肠末端组织，-80 ℃保存。

2. 病理学检查：胰腺组织和回肠组织以4%多聚甲醛溶液固定，经脱水、透明、包埋、切片后行HE染色，在光学显微镜下观察组织的病理变化。胰腺组织病理学评分参考Schmidt标准[3]，通过水肿、出血、坏死、炎症浸润四个方面进行评分；回肠组织病理学评分根据Chiu’s标准[4]对黏膜损伤、炎症反应、充血、出血等方面进行评分。

3. 血清学指标的检测：各组小鼠麻醉后眼球取血，3 000 r/min 4 ℃离心20 min，分离血清。采用全自动生物化学分析仪检测血清淀粉酶和脂肪酶，采用ELISA法检测炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)、肠道通透性(DAO、D-乳酸和LPS)水平，具体步骤按说明书进行操作。

4. 蛋白质印迹法：取胰腺组织和回肠组织，加入细胞裂解液裂解30 min，BCA法蛋白定量。取10 μg蛋白，行SDS-PAGE电泳，加入TLR4、MyD88一抗(工作浓度均为1∶1 000)，以Tubulin为内参；加入二抗(工作浓度1∶4 000)；曝光，显影，摄片。采用Image J软件测定条带灰度值，以目的蛋白的灰度值与内参灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达。

三、统计学分析

结 果

一、组织病理学损伤

1. 胰腺病理损伤：SO组各时间点胰腺组织均未见明显变化，偶见轻度叶内间隔扩张，无出血、坏死、炎症细胞浸润等病理改变。ANP组24 h、48 h和72 h均可观察到胰腺组织不同程度的水肿(叶内、小叶内、腺泡间、细胞间间隔增宽)、出血、腺泡坏死、炎性浸润等病理改变，且病理损伤随时间延长而加重(P<0.05)。与SO组相比，相应时间点ANP组病理学评分显著增高(P<0.05；图1)。

2. 肠道病理损伤：SO组各时间点回肠组织均未见明显变化，偶见固有层轻度炎症反应、毛细血管充血，无黏膜破损等病理改变。ANP组24 h、48 h和72 h均可观察到回肠组织不同程度的黏膜损伤，肠上皮和固有层内充血、出血，肠上皮和固有层内炎症细胞浸润等病理改变，且病理损伤呈时间依赖性(P<0.05)。与SO组相比，相应时间点ANP组肠道病理学评分显著增高(P<0.05；图2)。

二、血清淀粉酶和脂肪酶水平

与SO组相比，相应时间点ANP组血清淀粉酶和脂肪酶水平均显著升高(P<0.05)，ANP组72 h血清淀粉酶和脂肪酶水平达峰值(图3)。

*与相应时间点SO组比较，P<0.05

*与相应时间点SO组比较，P<0.05

*与相应时间点SO组比较，P<0.05

三、全身炎症反应和肠道通透性变化

1. 血清炎症变化：ELISA分析显示，与SO组相比，相应时间点ANP组小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均显著增高(P<0.05)，且ANP组血清IL-6水平呈时间依赖性(P<0.05；图4)。

2. 肠道通透性变化：与SO组相比，相应时间点ANP组血清DAO水平显著升高(P<0.05)，且呈时间依赖性(P<0.05)；ANP 48 h、72 h组血清LPS水平显著增高(P<0.05)，72 h组血清D-乳酸水平显著增高(P<0.05；图5)。

四、胰腺和肠道TLR4-MyD88通路

与SO组相比，相应时间点ANP组胰腺和回肠组织TLR4、MyD88蛋白表达显著增高，且呈时间依赖性(P<0.05；图6)。

讨 论

ANP是一种起病急、并发症多、死亡率高的急腹症，病理上以胰腺和胰周组织的局灶或弥漫性坏死、出血为主要特点，常以SIRS、MODS等并发症为特征[5]。完整的肠屏障包括机械屏障、生物屏障、化学屏障、免疫屏障；其中结构、功能完整的肠黏膜上皮与细胞间紧密连接组成的肠机械屏障在维持正常肠屏障功能中发挥重要作用。ANP状态下，肠道为最先受累的胰外器官之一，肠屏障功能障碍在SIRS和MODS的发病机制中起始动作用[6]。肠屏障功能障碍与ANP的第2个死亡高峰密切相关，其可导致肠道菌群移位，促进组织细胞因子和炎症介质释放，诱发SIRS和MODS[7]。

*与相应时间点SO组比较，P<0.05

*与相应时间点SO组比较，P<0.05

*与相应时间点SO组比较，P<0.05

本实验采用L-精氨酸腹腔内注射成功建立小鼠ANP模型，结果显示ANP小鼠回肠组织病理损伤明显，且呈时间依赖性，血清DAO、D-乳酸和LPS水平随着时间的延长而明显升高，提示肠道通透性增加，导致肠屏障功能障碍。这与Fishman等[8]在ANP小鼠模型中发现肠黏液层破坏以及肠道通透性增加的研究结果基本一致。

ANP病理情况下，肠道屏障功能障碍的发生机制包括缺血再灌注损伤、微循环障碍、炎性介质过度释放、肠上皮细胞损伤、肠道菌群失调等[9-11]。本研究发现ANP小鼠胰腺组织和肠道组织TLR4、MyD88蛋白表达较SO组明显上调，72 h时最为明显，提示在ANP病理条件下，TLR4-MyD88信号通路被激活。TLR4是一种通过识别LPS结合宿主细胞的模式识别受体，通过MyD88依赖性转导通路和非MyD88依赖性转导通路传递信号[12]。在生理条件下，肠上皮细胞TLR4低表达，但在病理状态下(如肠道缺血再灌注损伤、炎症性肠病等)，TLR4水平显著增高[13-16]，提示TLR4活化与肠道炎症性损伤相关。Yoshiya等[17]的研究发现，肠道菌群可通过活化TLR4加重缺血再灌注诱导的肠道病理损伤和炎症反应。有研究发现TLR4-MyD88信号通路的激活可降低肠道紧密连接蛋白(如ZO-1、Occludin等)的表达，增加肠道通透性[18]。

综上所述，在ANP状态下，肠道菌群失调，促进分泌LPS活化TLR4，激活TLR4-MyD88信号通路，加重肠道屏障功能障碍，从而进一步加重ANP。但本研究结论仍需行进一步研究证实。