母体孕期双酚A 暴露对子代大鼠学习记忆能力及海马中谷氨酸代谢酶基因表达的影响

于海洋， 刘娣， 裴秀丛， 段志文， 马明月， 段晓旭， 张玉敏

（沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室， 辽宁 沈阳110034）

双酚A （bisphenol A， BPA）， 又称2， 2－二（4－羟基苯基） 丙烷， 是明确的环境内分泌干扰物［1］， 常用于生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂， 随着人们对塑料制品的大量使用， BPA 已经在生产生活环境中无处不在［2－3］， 并且自2000 年以来，我国BPA 消费量显著增长， 已成为BPA 生产大国［4］。 现有研究表明， 水体和土壤等环境中存在BPA 污染， 且人群暴露也普遍存在［5－6］。 BPA 可造成多器官系统损伤， 由于神经系统损伤具有不可逆性， 且可对家庭和社会造成长期的经济负担，所以BPA 所致的儿童认知功能障碍越来越受到学者的关注［7］， 但机制仍未研究清楚。 海马是中枢神经系统的重要组成部分， 在学习、 记忆等认知功能中发挥重要作用。 谷氨酸（glutamate， Glu）是一种重要的兴奋性神经递质， Glu 含量的稳定在神经调节中发挥着关键作用， 对于学习记忆功能的维持具有重要意义［8］。 Glu 和谷氨酰胺（glutamine， Gln） 在神经元与星形胶质细胞之间的循环是维持Glu 含量的重要生理学过程， 其中谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase， GS） 是完成Glu与Gln 之间代谢转化， 维持Glu 含量的关键酶［9］。此外， Glu 可在谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase， GDH） 的作用下， 转化为α－酮戊二酸，进入三羧酸循环， 彻底分解清除［10］。 本研究拟通过建立母体孕期BPA 暴露模型， 探讨其对子代大鼠性成熟后学习记忆能力的影响， 及其对GS和GDH两种Glu 代谢酶基因表达的影响， 分析其内在联系， 研究结果可为揭示母体孕期BPA 暴露所致子代的学习记忆损伤机制提供新的研究数据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备 WMT－100S 水迷宫追踪与分析仪器（成都泰盟有限公司）， 核酸分析仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）， 7500 Fast 荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）， 超速低温离心机（德国Sigma 公司）， 超低温冰箱（日本Sanyo 公司）。

1.2 主要试剂 BPA （纯度＞99%） （日本Tokyo Chemical Industry 公司）， 玉米油（中国阿拉丁试剂公司）， Trizol、 反转录试剂盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒（日本Takara 公司）。

1.3 实验动物分组与染毒 10 周龄健康SPF 级SD 雌性大鼠30 只， 体重（220±20） g， 雄性大鼠15 只， 体重（320±20） g， （北京维通利华实验动物技术有限公司）， 实验动物生产许可证号：SCXK （京） 2012－0001。 大鼠饲养在符合GB 14925－2010 《实验动物环境及设施》 有关要求的屏障环境中， 自由进食、 饮水。 适应性饲养1 周后， 按照雌∶雄＝2∶1 比例合笼， 每日记录与雄鼠交配情况， 以观察到阴栓为妊娠期第0 天（gestational day 0， GD 0）。 将孕鼠随机分为对照组、0.05、 0.5、 5 和50 mg／ （kg·d） 的BPA 暴露组，每组6 只。 母鼠从GD 5 进行灌胃染毒至妊娠期结束前一天（GD 19）， 以玉米油为溶剂配制各浓度BPA 溶液， 对照组给予玉米油， 孕鼠饲养至自然分娩， 仔鼠于出生后第21 天（postnatal day 21，PND 21） 断乳， 至PND 56 实验结束。 取各组仔鼠， 每组6 只， 由于BPA 对学习记忆的影响是否存在性别差异尚未明确， 本研究中各组仔鼠为雌雄各半。 于PND 56 先进行水迷宫试验， 实验结束后， 称取体重， 经乙醚麻醉处死， 取仔鼠海马组织。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 Morris 水迷宫试验 水迷宫试验包括定位航行试验和空间探索试验。 首先， 将泳池注入温水， 并人为分为4 个象限， 在随机的一个象限中设置透明平台（定义为第Ⅱ象限）， 置于水面下2 cm 左右， 在整个定位航行试验中保持位置不变。随后将水池内注入奶粉， 避免大鼠可以通过视觉找到平台。 定位航行试验的5 d 内， 每天分别将4个象限的中心作为入水点， 将动物面向池壁放入水中， 检测其寻找平台的逃避潜伏期， 即大鼠从入水到找到平台所需要的时间， 反映大鼠空间学习能力， 如在120 s 内未能找到平台， 则逃避潜伏期记为120 s。 在第6 天训练时撤除平台， 进行空间探索试验， 观察并记录大鼠在120 s 内对原平台象限搜索时间（第Ⅱ象限停留时间）、 有效游泳速度、 进入平台次数及在对原平台位置的搜索时间（平台滞留时间）， 评价大鼠的空间记忆能力。

1.4.2 仔鼠体重的测定 乙醚麻醉处死前称取各组仔鼠体重。

1.4.3 仔鼠海马组织中GS与GDH的mRNA 含量测定 取各组仔鼠海马组织， 采用Real－time PCR法测定仔鼠海马中GS和GDHmRNA 含量。 按照Trizol 试剂盒的操作要求提取总RNA， 采用分光光度计在260 nm 和280 nm 波长处测定其光密度值，验证总RNA 的浓度与纯度。 按照反转录试剂盒操作， 将样本中的mRNA 转录为cDNA。 建立Realtime PCR 反应体系， 采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行检测， 应用7500 Fast 实时定量PCR仪， 测定各样本等质量总RNA 的mRNA 的循环指数（Cycle threshold， Ct） 值， 以GAPDH基因为内参照， 应用2－ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。 引物序列：GS上游： 5′－TTGCATCGGGTATGCGAAGA － 3′， 下 游： 5′ － TGGTGCCTCTTGCTCAGTTT－3′， 产物长度173 bp；GDH上游： 5′－ACCAAATCCAATGCACCCAGA－3′， 下游： 5′－ATAGTCCCGCCGTGCTTTC－ 3′， 产 物 长 度290 bp；GAPDH上游： 5′－GCAAGAGAGAGGCCCTCAG－3′，下游： 5′－TGTGAGGGAGATGCTCAGTG －3′， 产物长度74 bp。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析， 计量资料以均数±标准差表示， 多组间比较应用单因素方差分析， 组间两两比较采用LSD法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 母体孕期BPA 暴露对仔鼠空间学习与记忆能力的影响 在定位航行试验中， 自训练第3 天起，50 mg／ （kg·d） BPA 组仔鼠逃避潜伏期显著长于对照组和其他BPA 组（P＜0.05）； 自训练第4 天起， 5 mg／ （kg·d） BPA 组仔鼠逃避潜伏期也显著长于对照组和0.05 mg／ （kg·d） BPA 组（P＜0.05）； 在训练第5 天， 0.5、 5 和50 mg／ （kg·d） BPA 组仔鼠逃避潜伏期显著长于对照组（P＜0.05）， 其中5 和50 mg／ （kg·d） BPA 组也显著长于0.05 和0.5 mg／ （kg·d） BPA 组 （P＜0.05）。 见表1。

表1 各组仔鼠空间学习能力的比较（ ±s， s， n＝6）

表1 各组仔鼠空间学习能力的比较（ ±s， s， n＝6）

注： 与对照组比较，1）P＜0.05； 与0.05 mg／ （kg·d） BPA 组比较，2）P＜0.05； 与0.5 mg／ （kg／·d） BPA 组比较，3）P＜0.05； 与5 mg／（kg·d） BPA 组比较，4）P＜0.05

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在空间探索试验中， 5 和50 mg／ （kg·d）BPA 组仔鼠在第Ⅱ象限停留时间少于对照组和0.05 mg／ （kg·d） BPA 组， 其中50 mg／ （kg·d） BPA 组也少于0.5 mg／ （kg·d） BPA 组（P＜0.05）。 而各BPA 组仔鼠有效游泳速度与对照组相比较， 差异无统计学意义（P＞0.05）。 5 和50 mg／ （kg·d） BPA 组仔鼠进入平台次数少于对照组， 其中50 mg／ （kg·d） BPA 组也少于0.05 和0.5 mg／ （kg·d） BPA 组（P＜0.05）； 而5 和50 mg／ （kg·d） BPA 组仔鼠在平台滞留时间也少于对照组和0.05 mg／ （kg·d） BPA 组， 其中， 50 mg／ （kg·d） BPA 组少于0.5 mg／ （kg·d） BPA组（P＜0.05）。 见表2。

表2 各组仔鼠空间记忆能力的比较（±s， n＝6）

表2 各组仔鼠空间记忆能力的比较（±s， n＝6）

注： 与对照组比较，1）P＜0.05； 与0.05 mg／ （kg／·d） BPA 组比较，2）P＜0.05； 与0.5 mg／ （kg·d） BPA 组比较，3）P＜0.05

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2.2 母体孕期BPA 暴露对仔鼠体重的影响 对照组、 0.05、 0.5、 5 和50 mg／ （kg·d） 的BPA 暴露组仔鼠体重分别为（199.87±33.89）、 （218.68±33.24）、 （203.58±33.97）、 （245.08±48.88） 和（232.57±47.69） g， 各BPA 组仔鼠体重与对照组相比， 差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 母体孕期BPA 暴露对仔鼠海马组织中GS和GDH基因表达的影响 各BPA 组仔鼠海马组织中GS和GDH的mRNA 含量均低 于 对照 组 （P＜0.05）， 但各暴露组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。 见表3。

表3 各组仔鼠海马中GS 和GDH 基因表达的比较（ ±s， n＝6）

表3 各组仔鼠海马中GS 和GDH 基因表达的比较（ ±s， n＝6）

注： 与对照组比较，1）P＜0.05

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3 讨论

本研究选择了母体孕期BPA 暴露， 主要考虑孕期特殊生理状态， 孕鼠更容易受到BPA 的影响，并且该时期为神经系统发育的重要时期， 神经系统的损伤具有不可逆性； 此外， 孕期BPA 暴露对子代大鼠的影响研究较为少见。 选择PND 56 作为检测的时间节点， 主要考虑PND 56 为性成熟时间， 可用于评价孕期BPA 染毒对子代大鼠出生后的神经毒性效应。 体重是反映动物生长状态的基础指标， 本研究结果显示， 在该BPA 暴露模型下，未对子代大鼠一般生长状况产生显著的影响， 提示本研究暴露剂量的选择是较为适合的。

Morris 水迷宫试验是目前公认的探讨啮齿类动物学习记忆能力的检测手段之一［11－12］， 试验分为定位航行试验和空间探索试验， 分别反映受试动物的学习与记忆能力。 本研究结果显示， 在定位航行试验中， 0.5 mg／ （kg·d） BPA 暴露可显著延长大鼠的逃避潜伏期， 提示该剂量下母体孕期的BPA 暴露可损伤出生后（性成熟阶段） 子代大鼠的空间学习能力。 而在空间探索试验中， 当BPA 暴露剂量达到5 mg／ （kg·d） 时， 可导致大鼠第Ⅱ象限停留时间变短， 进入平台的次数变少以及在平台停留的时间变短， 但是对有效游泳速度这一指标并无显著影响。 大鼠在目的象限停留的时间， 可初步反映其对空间的位置记忆能力，而进入平台的次数以及在平台的停留时间可以进一步精准反映大鼠对原平台所在位置的记忆能力；上述检测指标的变化均可提示： 当母体孕期BPA暴露剂量达到5 mg／ （kg·d） 时， 可损伤子代大鼠的空间记忆能力； 而各组大鼠平均有效游泳速度并无显著差别， 提示本研究剂量下， BPA 对子代大鼠的运动能力， 尤其是游泳能力未产生显著不良影响。 结合定位航行和空间探索试验的结果可见， 孕期BPA 暴露对子代大鼠空间学习能力的影响更为显著， 因为较低剂量的BPA 暴露［0.5 mg／ （kg·d） ］ 即出现了大鼠学习能力的损伤，而更高剂量才可导致大鼠空间记忆能力的损伤。前期， 有部分研究者利用Morris 水迷宫试验探索BPA 对学习记忆能力的影响， 结果显示： 母鼠围产期及仔鼠出生后BPA 暴露均可损伤仔鼠的学习记忆能力［13－15］， 本研究结果与上述研究结果基本一致。 但是有关母体孕期BPA 暴露对仔鼠学习记忆功能的影响， 相关研究较为少见， 本研究结果提示孕期BPA 暴露可同样造成仔鼠学习记忆损伤，可补充该暴露时期相关研究的不足， 为揭示BPA导致的学习记忆损伤机制提供新的研究证据。

Glu 作为一种兴奋性神经递质， 其与Gln 之间的Glu－Gln 循环对中枢神经系统正常功能的维持，尤其是学习记忆能力的发挥具有重要作用［16－17］，而GS 和GDH 在Glu－Gln 循环中扮演重要角色。本研究结果显示， 当孕期BPA 暴露剂量达到0.05 mg／ （kg·d） 时， 仔鼠海马中GS和GDH的mRNA含量显著均低于对照组， 提示0.05 mg／ （kg·d） 的孕期BPA 暴露可抑制GS和GDH的基因表达。 前期研究显示， BPA 暴露可影响海马中Glu 含量及Glu／GABA［18－19］， 而对引起其含量变化的可能代谢环节及关键位点研究不足， 确切机制尚未明确，本研究结果可为上述问题提供新的实验数据和研究思路。

综上所述， 母体孕期BPA 暴露可导致子代大鼠性成熟阶段学习记忆损伤， 可抑制Glu 代谢酶GS和GDH的基因表达，GS和GDH基因表达的改变可能参与了BPA 所致的学习记忆损伤过程。 但是， 本研究的不足之处是未检测GS 和GDH 的蛋白表达及酶活性的变化， 也未对Glu 代谢其他环节进行探讨， 将在后续的研究中进行补充和深入探索。