雄激素受体可变剪接异变体7 与前列腺癌关系的研究进展

于冰冰,李扬,邵晨

（吉林大学基础医学院病理生理学系，吉林 长春 130021）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性生殖系统常见的恶性肿瘤，在世界范围内，PCa 发病率在所有男性恶性肿瘤中位居第2 位，2018 年全世界约有36 万人死于PCa 相关疾病，是全球男性肿瘤死亡的第五大原因［1］。近年来，随着我国人口老龄化和生活方式的改变，PCa 患者的发病率和死亡率呈明显上升趋势，已成为影响我国男性健康的重要疾病之一。由于早期PCa 常无症状，与欧美发达国家比较，我国对PCa 易感人群的筛查工作相对落后，初诊患者晚期PCa 比例更高［2-4］。

目前，PCa 的治疗手段主要包括PCa 根治术、放射治疗、全身化疗和雄激素阻断治疗（androgen deprivation therapies，ADT）等［5］。ADT 是转移性PCa 的标准治疗方法，是通过抑制雄激素分泌和拮抗雄激素受体（androgen receptor，AR）的作用阻断AR 转录，包括手术去势法和药物去势法［6］。由于PCa 存在雄激素依赖性，ADT 对多数PCa 患者早期治疗效果良好，可延缓激素敏感性PCa 进展，因此被作为临床上常规的PCa 治疗方式。然而，ADT 并不能治愈PCa，在经历18～24 个月有效期后，几乎所有患者均会发生激素抵抗并产生耐药性，逐渐且不可逆地演变为去势抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer，CRPC），并且多数患者伴有骨转移以及远处脏器转移［7］。CRPC 是指PCa 患者经过初次持续ADT 治疗后，血清睾酮水平达到去势水平（＜1.7 nmol·L－1），但疾病依然进展的PCa。CRPC 表现为雄激素非依赖性，并且恶性程度更高，是导致临床治疗失败和患者死亡的主要原因。

虽然CRPC 患者雄激素合成被阻断，但多数CRPC 患者仍可表达AR，AR 信号通路异常激活是促进癌细胞生存和生长的决定性因素［8］。研究［9］显示：雄激素受体可变剪接异变体7（androgen receptor splice variant 7，AR-V7）在CRPC 肿瘤细胞和组织中表达水平较高，AR-V7 阳性患者预后较差。近年来研究［10］表明：AR-V7 在PCa 对紫杉烷类及AR 靶向药物耐药性的形成过程中具有促进作用，但是AR-V7 诱导PCa 细胞耐药性产生的具体分子机制尚不清楚。现就AR-V7 在CRPC 发生发展和耐药过程中的作用，探讨AR-V7 诱导PCa 细胞耐药的分子机制，为AR-V7 作为CRPC诊断及预后生物标志物和治疗新靶点提供理论依据。

1 AR 的结构和功能

AR 属于类固醇激素受体超家族中的一员，是存在于正常前列腺组织中的一种配体依赖性转录调节因子，可调控其下游基因的表达。正常情况下，AR 与5α-双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）和睾酮结合是男性性别分化及发育的先决条件，AR 在细胞核中与其下游基因，如前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）和跨膜丝氨酸蛋白酶 2（transmembrane protease serine 2，TMPRSS2）的启动子结合，募集多种转录共调节因子，维持细胞生长和存活［11］。但是，AR 同时也存在于PCa 细胞中，在PCa 的发生发展过程中发挥重要作用。全长AR（full-length androgen receptor，AR-FL）由4 个结构域构成（图1）［8，11-12］：①具有独立转录活化功能的氨基端结构域（N-terminal domain，NTD），为外显子1 编码，转录共调节因子可与其特异性结合位点结合，缺乏LBD 或雄激素时可激活靶基因的转录，在AR 转录活化中起关键作用。②高度保守的DNA 结合结构域（DNAbinding domain，DBD），为外显子2 和3 编码，其作为特异性碱基的结合位点可识别靶基因中的雄激素反应元件（androgen response elements，AREs），与靶基因结合并控制其表达。③配体结合结构域（ligand-binding domain，LBD），为外显子4～8 编码，雄激素与AR 结合的位点，负责激素识别并保证信号传导途径的特异性和选择性。④连接DBD 和LBD 的铰链区（hinge domain，HD），为外显子4 编码，包含核定位信号（nuclear localization signal，NLS），能够介导AR 核转运以及调节AR 与DNA 结合、共活化因子的募集以及AR 的N-C 二聚化。当雄激素与AR 的LBD 在细胞质结合后，AR 结构发生改变，AR 的NTD 与LBD通过N-C 端相互作用进行分子内二聚化，导致铰链区的NLS 暴露，在核转运子的协助下从细胞质转移到细胞核。激活后AR 的DBD 可与雄激素反应元件（AREs）结合，诱导转录复合物的组装，调控包括 PSA、TMPRSS2 和己糖激酶 2（hexokinase 2，HK2）在内的下游基因表达，促进PCa 的发生发展和转移。

图1 AR-FL 和AR-V7 结构示意图Fig.1 Structure diagram of AR-FL and AR-V7

2 AR 信号通路的异常激活机制

在雄激素耗尽的情况下AR 仍可被激活。在CRPC 中尽管雄激素水平被抑制，但AR 信号通路异常激活在CRPC 中仍起着至关重要的作用。目前AR 异常激活主要包括以下几种途径：①AR 基因扩增。CRPC 的发展与AR 基因扩增或其他机制导致的AR 表达增加有关，但AR 基因扩增并不是AR信号通路异常激活的主要原因［13］。②AR 基因突变。多数已检测到的突变位于LBD，可导致AR 雄激素非依赖性激活，这也是ADT 后PCa 细胞产生抗性的原因之一。研究［14］表明：雄激素缺乏或抗雄激素的药物存在是AR 基因突变的选择压力，用AR 靶向药物治疗可增加AR 基因突变的发生率。③AR 的翻译后修饰。在ADT 期间持续激活的AR转录活性可能是AR 翻译后磷酸化修饰所致。研究［15］显示：Src 基因（sarcoma gene）诱导AR 的Y534 位点磷酸化可导致AR 对低水平雄激素敏感和AR 的雄激素非依赖性激活。上皮和内皮酪氨酸激酶（epithelial and endothelial tyrosine kinase，Etk）作为非受体型酪氨酸激酶和Src 与磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的下游效应物，其表达在ADT 期间明显上调，并能够通过在Y534 和Y551/Y552 位点磷酸化AR 从而稳定AR 并在无雄激素时促进AR 活性［12］。④AR 共激活因子过表达。染色质免疫沉淀实验结果显示：在CRPC 细胞中AR 共激活因子MED1 和AR 协作因子FoxA1、GATA2 活性增强，而沉默这些因子可使AR 下游基因（UBE2C）表达水平降低。白细胞介素6 介导的核受体辅激活因子1（NCoA1 或Src1）的磷酸化以配体非依赖性方式促进AR 转录，而且丝裂原活化蛋白激酶（mitogenic activated protein kinase，MAPK）介导的该共激活因子的磷酸化可能增加AR 与雄激素的亲和性，导致疾病复发和CRPC 的进展［16］。⑤AR 可变剪接异变体（androgen receptor splice variants，ARVs）的表达。2008 年以来，研究者在转移性PCa 中陆续发现了20 多种ARVs。ARVs 表达是AR 持续激活、PCa 细胞生存以及ADT 后疾病进展的重要机制之一［16］。随着相关研究的不断深入，研究者认为ARVs 的发现具有重要的临床意义，ARVs 表达水平与肿瘤进展加速和生存期较短有密切关联，且可能作为预测PCa 患者预后的标志物［17］。多数ARVs 缺乏LBD，即使在没有配体的情况下，也具有转录活性。AR 活性受到ARVs 调控：ARVs 活化导致类固醇生成酶上调，可为AR 提供更多配体；同时，ARVs 可增加AR 调节基因的表达，导致AR 信号通路在配体缺失条件下异常激活［18］。虽然在PCa 细胞中通过雄激素拮抗剂抑制LBD 可增加ARVs 的表达，但ARVs 表达的调控机制尚不清楚。

3 PCa 中ARVs 的产生及结构

ARVs 最早发现于21 世纪初期，不同的研究团队在PCa 细胞系（22Rv1、VCaP 和CWR-R1）、人异种移植物（LuCaP 86.2 和LuCaP 136）和临床PCa标本中共发现17种缺乏LBD 的ARVs［16］。良性前列腺组织中也可以检测到ARVs，但其在正常前列腺组织或细胞中的作用尚不清楚。ARVs 可能在驱动肿瘤起始中不发挥作用，但在ADT 期间驱动肿瘤进展中发挥作用。部分ARVs 具有组成型活性，在没有配体激活条件下即可表现出一定程度的活性，如AR-V7（也称为AR3）和ARv567es（也称为AR-V12）［17］；而另一部分ARVs 则需要在配体激活条件下才具有活性，如AR-V1 和AR-V9。除AR45 的NTD 截短，其他变体均含有完整的NTD，但缺乏与雄激素结合的LBD。多数ARVs均含有完整的DBD，可以与靶基因结合，调控靶基因表达［13］。

ARVs 可能是体细胞无义突变、AR 基因中提前引入终止密码子、AR 基因重排或AR 蛋白翻译后水解的产物，上述遗传和表观遗传机制介导了ARVs 的产生［13，16］。ARVs 最明显的特征是缺乏编码LBD 的开放阅读框，可能是编码DBD 的外显子下游插入隐蔽外显子或编码C 末端结构域的外显子的缺失所致。缺乏LBD 的AR 同种型是PCa 进展的重要因素，其在CRPC 进展和针对该结构域的治疗中发挥重要作用。多数ARVs 保留NTD 与AF1 反式激活结构域和DBD，因此可组成性激活并且能够独立于配体维持基因转录。雄激素存在与否，ARVs 均定位于细胞核，导致AR 信号传导途径雄激素非依赖性激活。

在现已发现的ARVs 中，截短的变体AR-V7和外显子跳跃变体ARv567es 在PCa 中具有重要的临床意义，且两者均在原发性前列腺肿瘤和转移瘤中表达，主要区别是AR-V7 无HD，而ARv567es具有完整的HD［18］。ARv567es 和AR-V7 作为组成型活性受体，不依赖于LBD 即可增强AR 转录活性，促进AR-FL 表达，进而促进CRPC 进展［19］。研究［20-21］表明：在无雄激素的条件下，特异性敲低雄激素非依赖性细胞系22Rv1 和CWR-R1 中内源性AR-V7 和ARv567es 可抑制肿瘤细胞生长，恢复肿瘤细胞对雄激素和恩杂鲁胺的反应。此外，AR-V7 和ARv567es 的过表达可在雄激素依赖性LNCaP 细胞中驱动其在ADT 期间继续存活。由于AR-V7 是目前研究最多且是临床上检测到表达水平最高的ARVs，因此本文作者将以AR-V7 为核心探讨其与PCa 发生发展的关系。

4 AR-V7 与AR 的关系

目前尚未发现独立于AR 而单独存在的AR-V7，表达AR-V7 的PCa 细胞也同时表达AR-FL，但细胞表达AR-FL 不一定同时表达ARV7，因此比较AR-V7 与AR 的异同对分析AR-V7的功能尤其重要。AR 靶基因的激活需要AR 共调节蛋白和其他转录协同因子共同作用，因此AR 活性不仅由雄激素介导，还受AR 同源二聚体及其辅助因子的相互作用。研究［21］显示：AR-V7 也需要二聚化以发挥其转录活性。AR-V7 不仅可以同源二聚体化，还可以与AR 异二聚化，导致AR 的雄激素非依赖性核定位和转录活性。虽然AR-V7 与AR 存在许多重叠的靶基因，可以在特定条件下替代AR 调节下游基因的转录，但是AR 与AR-V7 分别介导不同的细胞周期基因表达谱，AR 主要调控与分子合成有关的基因，而AR-V7 可特异性增加包括UBE2C 在内的细胞周期相关基因的表达［22-23］。此外，AR-V7 还可以诱导上皮间质转变（epithelial-mesenchymal transition，EMT），AR-V7的表达导致间充质标记物（N-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail 和Zeb1）上调［24-26］，上述研究证明转移性PCa 标本中AR-V7 表达水平增加，表明AR-V7信号转导与EMT 之间存在关联，可能与PCa 的转移和治疗抗性有关联［27-28］。此外，AR-V7 可以促进AR 的核转移，并且协助AR 逃逸化疗药物对其核转移和信号通路的抑制作用，从而促进PCa 耐药性形成和CRPC 的进展。

5 AR-V7 与PCa 治疗

多烯紫杉醇（docetaxel）是第一种与转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）生存获益相关的一线化疗药物，2004 年美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准以多烯紫杉醇为基础的化疗药物治疗mCRPC［29］。尽管PCa 患者应用多烯紫杉醇治疗后常会产生耐药性，但多烯紫杉醇仍然广泛应用于临床。多烯紫杉醇通过影响细胞周期，使肿瘤细胞阻滞在有丝分裂期（G2/M 期），诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长［30-32］。多烯紫杉醇治疗后，AR 信号仍然是PCa 生长的关键驱动因素。

鉴于AR 信号转导在促进晚期PCa 发展中的关键作用，AR 靶向药物被应用为多烯紫杉醇后CRPC 患者的主要用药，为PCa 的治疗提供了新思路。抑制雄激素合成和抑制雄激素与AR 结合的药物相继问世，现已经证实阿比特龙（abiraterone）和恩杂鲁胺（enzalutamide）可有效延长CRPC 患者的总生存率［33］。①阿比特龙：FDA 于2011 年批准阿比特龙用于治疗多烯紫杉醇治疗效果不佳的CRPC 患者，可延长患者总生存期（overall survival，OS）。阿比特龙不可逆地拮抗细胞色素P450 C17（cytochrome P450 17A1，CYP-17），CYP-17 是雄激素合成中具有裂解酶和17-α 羟化酶活性的关键酶，阿比特龙可阻断肾上腺、睾丸和前列腺中雄激素的合成，从而抑制PCa 细胞的生长。此外，阿比特龙还可通过抑制AR mRNA 的表达和降低AR 蛋白水平等阻断AR信号通路［17］。②恩杂鲁胺（MDV-3100）：恩杂鲁胺于2012 年被FDA 批准用于治疗mCRPC，是一种新型AR 拮抗剂，与AR 具有高度亲和力，其通过与AR 的LBD结合，阻断雄激素与AR 的结合，进而抑制AR 的核转移、与DNA 的结合及其共激活物募集的能力，达到抑制AR 信号通路正常激活的作用，从而抑制PCa 细胞的生长和增殖，延缓PCa 的进展，可以作为紫杉醇治疗失败CRPC 患者的一线用药［7，9，17］。

尽管上述药物代表了CRPC 治疗上的突破，但几乎所有患者都不可避免地在1～2 年内产生耐药性。在PCa 组织中，AR 的增殖或突变可使其对低含量的雄激素敏感，从而导致PCa 的进展［7］。最近研究［14］显示：PCa 对阿比特龙和恩杂鲁胺的耐药性与ARVs 的表达有关。

5.1 AR-V7 与AR 靶向药物AR-V7 是PCa 中最常见、表达量最高的一种ARVs，主要定位于细胞核。采用RT-PCR 法检测AR-V7 mRNA 表达情况［12］，结果显示：在CRPC 中AR-V7 mRNA 表达水平较正常组织增加约20 倍。在正常前列腺组织和早期PCa 细胞中AR-V7 蛋白表达水平极低，并且其表达水平随着疾病进展而增加。PCa 临床标本中AR-V7 mRNA 表达水平与蛋白表达水平间并不总是存在相关性，可能是由于使用了不准确的检测方法，或者一些潜在因素抑制AR-V7 mRNA 的表达。AR-V7 由连续剪接的AR 外显子1、2、3 及隐蔽外显子3（cryptic exon 3，CE3）编码，AR-V7具有完整的NTD 和DBD，但缺乏LBD 和HD，并由一段短肽序列代替。AR 的NLS 位于HD，但AR-V7 缺乏HD，NLS 由CE3 编码，这种特殊结构使其持续活化，在无配体结合状态下完成核转运并激活AR 信号通路，招募辅助因子完成下游基因的转录激活。由于AR-V7 缺乏LBD，传统的ADT药物阿比特龙和恩杂鲁胺均通过该区域发挥抑制作用，因此AR-V7 在协助PCa 细胞逃避恩杂鲁胺和阿比特龙等药物对AR 信号通路的抑制效应方面起着决定性作用，从而导致PCa 耐药性和CRPC 的进展［17，19，34］。ADT 期间低水平雄激素的刺激以及广泛应用AR 靶向药物，导致AR-V7 持续激活，从而导致CRPC 复发和耐药性的产生。

2014 年ANTONARAKIS 等［19］研究表明：CRPC 患者循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）中AR-V7 mRNA 表达水平与恩杂鲁胺和阿比特龙的耐药性有关。与AR-V7 阴性患者比较，AR-V7 阳性患者PSA 反应率明显降低，PSA 无进展生存期（PSA progression-free survival，PSAPFS）较短，临床或影像学无进展生存期较短［35］。在临床实践中，AR-V7 在PCa 细胞对AR 靶向药物耐药性中的具有重要作用，可预测下一代AR 靶向药物的抗性，故AR-V7 可作为CRPC 预后不良的生物标志物。由于AR-V7 可能参与AR 靶向药物潜在逃逸过程，研究人员正在开发新的试图通过识别和阻断AR-V7 的AR 拮抗剂（EPI-001、ARN-509、VT-464、AZD3514 和ODM-201）。

AR-V7 与PCa 的发展存在密切关联，AR-V7转录后调控也逐渐成为PCa 治疗中的重要环节［36］，其中包括增加 PCa 中 AR-V7 蛋白降解。Galeterone 可诱导AR 和AR-V7 蛋白的降解，抑制CRPC 的进展；白藜芦醇可以促进AR-V7 的降解。氯硝柳胺也可明显下调AR-V7 蛋白水平。但目前对AR-V7 转录后调控模式的了解有限，仍需进一步探索。

5.2 AR-V7 与多烯紫杉醇多烯紫杉醇是广泛用于mCRPC 的一线治疗，属于紫衫烷类化疗药物。多烯紫杉醇可与β-微管蛋白结合而减少其解聚作用，通过稳定微管和抑制微管动力阻碍有丝分裂纺锤体形成，并持续激活纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint，SAC），从而导致有丝分裂阻滞并最终导致细胞死亡［29，37］。近年来研究［38］表明：在多种PCa 细胞中，AR 活性与PCa 细胞对多烯紫杉醇的敏感性呈负相关关系，多烯紫杉醇主要通过干扰微管阻碍转录因子AR 入核，从而抑制AR 下游促生长基因（PSA 等）的表达发挥抑制细胞生长的作用。KUMORA 等［39］通过对比不同PCa 细胞中AR 活性和多烯紫杉醇敏感性的差异发现： AR 通路异常激活促进了多烯紫杉醇耐药性的发生。

HD 是AR 与微管相互作用的部位，AR-V7 无法与微管蛋白相互作用，核定位不受紫杉醇类药物的影响。AR-V7 可以通过激活AR 信号通路从而使PCa 细胞对多烯紫杉醇的敏感性降低，最终导致耐药性。研究［39-40］表明：高表达AR-V7 后，PCa 细胞对多烯紫杉醇敏感性降低。AR-V7 也可通过调控其下游基因进而降低多烯紫杉醇对PCa 细胞的杀伤作用，具体作用机制仍需继续探索。但是，许多临床实验结果并未证实AR-V7 在促进紫杉醇类药物耐受的作用。此外，AR-V7 阳性CRPC 患者接受紫杉烷治疗较AR 靶向治疗效果明显，而在AR-V7 阴性患者中，紫衫烷治疗效果与阿比特龙和恩杂鲁胺治疗效果无明显差异，提示AR-V7 的状态可能是选择 PCa 治疗方式的可靠指标［5，21，30］。AR-V7 与PCa 患者紫杉醇耐受间的关系仍需要更多样本的验证和后续的深入研究。

6 AR-V7 的临床应用评估

由于临床上缺乏对个体ARVs 的特异性抗体检测以及CRPC 相关的组织储存不足，导致在临床上验证ARVs 的作用受到一定程度的限制，但目前证据表明ARVs 可能是PCa 进展的促进因素。GUO 等［15］通过免疫组织化学方法评估了CRPC 和良性肿瘤样本中AR-V7 蛋白表达，结果显示：44%的CRPC 样本中AR-V7 蛋白呈阳性表达，而在良性肿瘤样本中AR-V7 蛋白呈阴性表达，并且AR-V7 高表达在根治性前列腺切除术后复发风险更高。研究［12，41］表明：AR-V7 阳性PCa 患者样本数量和AR-V7 mRNA 表达水平均随着PCa 进展而增加，并且AR-V7 mRNA 高水平表达的患者手术后中位PFS 和中位OS 较短，AR-V7 表达与PCa 患者预后不良和复发有密切关联。大量临床证据提示：AR-V7 表达在CRPC 进展及PCa 耐药性产生过程中具有重要作用。

7 小结及展望

随着PCa 发病率和死亡率的逐年升高，PCa 已经严重威胁中老年男性的健康。AR 信号通路在PCa 发生发展过程中具有重要作用，即使治疗初期ADT 可以在一定程度上缓解PCa 进展，但PCa 患者最终不可逆地发展为CRPC 以及产生耐药性，严重阻碍了PCa 的治疗效果。AR-V7 表达所导致的AR 信号通路异常激活，是促进CRPC 发展和产生耐药性的关键因素之一，虽然具体机制目前尚未完全阐明，但揭示AR 和AR-V7 的交互调控机制及差异将会为PCa 的治疗提供新的方向［31，33，42］。在今后的临床实践中可以通过检测晚期PCa 患者AR-V7 mRNA 和蛋白表达水平，选择个体化治疗方案。同时，随着临床样本量的扩大和细胞机制研究的深入，AR-V7 也可能作为预测PCa 进展以及对化疗药物敏感性的生物标志物［30，43-44］。