LncRNA-ATB 通过调节miR-200c 表达对肾移植大鼠急性排斥反应的影响

乔良伟,曲青山,李明

（郑州人民医院器官移植中心肾脏移植科，河南 郑州 450000）

肾移植是治疗终末期肾病（end-stage kidney disease，ESRD）的有效手段，排斥反应是肾移植术后的主要难题和并发症，也是影响移植肾长期存活的主要危险因素，目前临床上最常见的排斥反应类型是急性排斥反应（acute rejection，AR）［1］。近年来，随着免疫抑制剂的出现，肾移植后排斥反应发生率不断下降，但仍时有发生。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一类不具有蛋白编码功能的RNA，广泛参与调节机体的各项基础生物进程，其表达水平异常与多种疾病的发生发展存在密切关联［2］。被转化生长因子β 活化的长链非编码 RNA（long non-coding RNA activated by TGF-β，LncRNA-ATB）是LncRNAs的重要成员，参与细胞增殖、凋亡、转移和侵袭等多种生理过程［3］。既往研究［4］表明：LncRNAATB 在器官移植免疫排斥反应中起调控作用，但在肾移植方面报道较少。本研究通过沉默肾移植模型大鼠LncRNA-ATB 的表达，探讨LncRNA-ATB对肾移植大鼠移植后AR 和受体组织炎症反应的影响，分析肾移植AR 潜在的分子机制，为临床诊断和治疗AR 提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器供体：雄性SD大鼠30只，SPF级，7～8 周龄，体质量250～300 g；受体：雄性Wistar 大鼠40 只，SPF 级，7～8 周龄，体质量230～300 g；均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0001。所有大鼠术前12h禁食不禁水。含有LncRNA-ATB-短发夹（shRNA）和LncRNA-ATB-NC 的psiCHECK2 基因重组质粒（上海吉玛公司），Opti-MEM 培养基和脂质体 2000（Lipofectamine 2000）（美国Invitrogen公司），白细胞介素6（interleukin6，IL-6）、白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒（美国Abcam公司），兔抗大鼠Toll 样受体4（Toll-like receptor-4，TLR4）、髓样细胞分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和核转录因子 κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）多抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔MyD88 和NF-κB单抗（英国Abcam公司）。7600 全自动生化分析仪（日本Hitachi 公司），Cary3500 紫外分光光度计（美国安捷伦公司），550 型全自动酶标仪和PowerPac 系列电泳仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 大鼠肾移植AR 模型建立和分组供体和受体大鼠腹腔注射水合氯醛溶液（10%W/V）进行麻醉，固定于手术台上。供体30 只SD 大鼠经中线切口暴露腹主动脉、左肾及其所属动静脉，结扎肾上腺动静脉，游离左肾及肾动静脉，分离输尿管，用4℃含肝素生理盐水灌注左肾阻断肾脏血液供应，切断左肾静脉，待左肾颜色变为黄白色且左肾静脉流出清亮的灌注液后，切断左肾动脉，取出肾脏保存于4℃含肝素生理盐水中，剪去供肾多余脂肪及腔静脉，以利血管吻合。受体30 只Wistar 大鼠暴露左肾后移除，将供肾放置左肾窝，左肾静脉采用cuff 套管吻合法，动脉采用端端吻合法。吻合完成后打开血管夹，数秒内可见左肾颜色变红，少量尿液从输尿管排出。术后肌肉注射青霉素10 万单位，连续3 d。其余10 只Wistar 大鼠为假手术组，开腹后随即连续全层关闭，其他操作同上。术后所有大鼠均给予正常饮食和饮水。术后将移植成功的27 只大鼠（死亡3 只）随机分为模型组、LncRNA-ATB-shRNA 组和LncRNA-ATB-NC 组，每组9 只。

1.3 干预方法制备质粒脂质体复合物：按照Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明书，将5 μg 含有LncRNA-ATB-shRNA（或LncRNA-ATB-NC）的 psiCHECK2 基因重组质粒、10μL Lipofectamine 2000 分别用Opti-MEM 培养基稀释至总体积各为30 μL，室温静置5 min，然后将2 种液体混合均匀，室温放置30 min，获得质粒脂质体复合物备用。肾移植术后2 h 分别将2 种质粒脂质体复合物用Opti-MEM 培养基稀释至总体积200 μL，经尾静脉分别快速注入LncRNA-ATBshRNA 组和LncRNA-ATB-NC 组大鼠体内。假手术组和模型组大鼠按每只200 μL 尾静脉注射Opti-MEM 培养基。

1.4 RT-PCR 法检测大鼠外周血中LncRNAATB、微小RNA（microRNA，miRNA）-200c 表达水平各组大鼠干预7 d 后，腹主动脉采血2 mL 放入抗凝管中，按照TRIzol 说明书提取总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA 纯度和浓度，将提取的总RNA 按试剂盒说明书进行逆转录得到相对应的cDNA，进行产物扩增。以cDNA 为模板，配制反应体系：SYBR GREEN MasterMix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板cDNA 1 μL，加双蒸水至总体积20 μL。反应条件：预变性94℃、10 min；变性94℃、10 s，退火60℃、30 s，延伸70℃、20 s，35 个循环，每个样本检测3 次，取平均数。引物均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，LncRNA-ATB 以β-actin 为内参，miR-200c 以U6 为内参，采用2－△△Ct法计算LncRNA-ATB 和miR-200c 表达水平。引物序列见表1。

1.5 全自动生化分析仪检测各组大鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平各组大鼠腹主动脉采血，离心半径12cm，3 000 r·min－1离心20 min，取上清-20℃冰箱保存。采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中Scr 和BUN 水平。

表1 LncRNA-ATB 和miR-200c PCR 扩增引物序列Tab.1 Sequences of LncRNA-ATB,miR-200c PCR amplification primer

1.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组大鼠血清中IL-6、IL-8 和TNF-α 水平取保存血清，严格按照ELISA 试剂盒说明书操作步骤，检测大鼠血清中IL-6、IL-8 和TNF-α水平，用酶标仪在490 nm波长处测量吸光度（A）值，以标准品浓度和A 值绘制标准曲线，分别根据公式Y ＝0.970 1X+0.011 8、Y ＝1.025 3X－0.001 7 和Y ＝0.974 6X+0.011 4 计算待测样品IL-6、IL-8 和TNF-α 水平。

1.7 各组大鼠肾组织病理学观察及AR 分级采血完毕，处死各组大鼠，无菌摘取左肾并切分成两半，一半置于体积分数为10%中性甲醛保存备用。取中性甲醛中保存的肾组织，常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，置于光镜下观察大鼠肾组织病理形态表现。AR 的诊断参照Banff 2007 移植肾病理学分类标准［5］，按照严重程度分为7 级：正常、临界性改变、Ⅰa 级、Ⅰb 级、Ⅱa 级、Ⅱb 级和Ⅲ级。AR 分级半定量评分：正常为0 分，临界性改变为1 分，Ⅰa 为2 分，Ⅰb 级为3 分，Ⅱa 级为4 分，Ⅱb 级为5 分，Ⅲ级为6 分。

1.8 RT-PCR 法检测各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 中NF-κB mRNA 表达水平采血完毕，处死大鼠，无菌摘取左肾并切分成两半，一半置于液氮中保存备用。取液氮中保存的肾组织100 mg，按照TRIzol 试剂盒说明书提取总RNA，测定RNA纯度和浓度后进行cDNA 逆转录，配制20 μL 反应体系：模板cDNA 2 μL，上下游引物各2 μL，Taq DNA 聚合酶10 μL，双蒸水6 μL。以转录产物cDNA 为模板，以β-actin 为内参，进行PCR 扩增。扩增条件：预变性95℃、10 min，变性95℃、60 s，退火55℃、30 s，延伸65℃、30 s，共40 个循环。各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表达水平按2－ΔΔCt法计算。引物序列见表2。

表2 PCR 扩增引物序列Tab.2 Sequences of PCR amplification primers

1.9 Western blotting 法检测各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平取液氮保存的肾组织100 mg，在液氮中研磨后离心取上清，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，制备蛋白样品，蛋白上样进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨（SDSPAGE）凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶孵育2 h，加入稀释的一抗 TLR4（1 ∶1 000），MyD88（1 ∶1 000）、NF-κ B（1 ∶1 000）和β-actin（1∶1 000），4℃摇床封闭过夜，洗膜后加入稀释的二抗（1∶4 000）于室温下摇床孵育1 h，洗膜后加入ELC 试剂显影，暗室下曝光成像。采用Image J 软件分析图像，计算TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/β-actin 蛋白条带灰度值。

1.10 统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。采用KS 检验数据正态分布，各组大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c 表达水平，血清中Scr、BUN，IL-6、IL-8 和TNF-α 水平，肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 及蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两组间样本均数比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c 表达水平各组大鼠外周血中LncRNA-ATB和miR-200c 表达水平组间比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组、LncRNA-ATB-NC 组和LncRNA-ATB-shRNA 组大鼠外周血中LncRNA-ATB 表达水平均升高（P＜0.05），miR-200c 表达水平均降低（P＜0.05）；与模型组和LncRNA-ATB-NC 组比较，LncRNA-ATB-shRNA 组LncRNA-ATB 表达水平降低（P＜0.05），miR-200c 表达水平升高（P＜0.05）；模型组与LncRNA-ATB-NC 组大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c 表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.2 各组大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平各组大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组、LncRNAATB-NC 组和LncRNA-ATB-shRNA 组大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平均升高（P＜0.05）；与模型组和LncRNA-ATB-NC 组比较，LncRNA-ATB-shRNA 组大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α水平均降低（P＜0.05）；模型组与LncRNA-ATB-NC 组大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表3 各组大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c mRNA表达水平Tab.3 Expression levels of LncRNA-ATB and miR-200c mRNA in peripheral blood of rats in various groups（）

表3 各组大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c mRNA表达水平Tab.3 Expression levels of LncRNA-ATB and miR-200c mRNA in peripheral blood of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group ；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with LncRNA-ATB-NC group.

2.3 HE 染色观察各组大鼠肾组织病理形态表现和AR 分级半定量评分HE染色，假手术组大鼠肾组织无AR，结构清楚；模型组大鼠出现典型AR，表现为炎性细胞浸润、动脉炎症、间质细胞水肿和皮质出血等；LncRNA-ATB-NC 组与模型组肾组织病理形态表现相似；LncRNA-ATBshRNA 组大鼠肾组织病理形态表现较模型组和LncRNA-ATB-NC 组均减轻。假手术组、模型组、LncRNA-ATB-NC 组和LncRNA-ATB-shRNA 组的AR 分级半定量评分分别为（0.00±0.00）分、（4.26±0.44）分、（4.54±0.45）分和（1.75±0.18）分。AR 分级半定量评分组间比较差异均有统计学意义（F＝425.923，P＜0.05）。与假手术组比较，模型组、LncRNA-ATB-NC 组和LncRNA-ATB-shRNA 组的AR 分级半定量评分均升高（P＜0.05）；与模型组和LncRNA-ATB-NC组比较，LncRNA-ATB-shRNA 组的AR 分级半定量评分降低（P＜0.05）；模型组与LncRNA-ATBNC 组的AR 分级半定量评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

表4 各组大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of Scr,BUN,IL-6,IL-8,and TNF-α in serum of rats in various groups（）

表4 各组大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of Scr,BUN,IL-6,IL-8,and TNF-α in serum of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group ；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with LncRNA-ATB-NC group .

2.4 各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表达水平各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 相对表达水平组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组、LncRNA-ATB-NC 组和LncRNA-ATBshRNA 组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表达水平均升高（P＜0.05）；与模型组和LncRNA-ATB-NC 组比较，LncRNA-ATB-shRNA组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA表达水平均降低（P＜0.05）；模型组与LncRNAATB-NC 组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表达水平Tab.5 Expression levels of TLR4,MyD88 and NF-κB mRNA in kidney tissue of rats in various groups（）

表5 各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表达水平Tab.5 Expression levels of TLR4,MyD88 and NF-κB mRNA in kidney tissue of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with LncRNA-ATB-NC group.

2.5 各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB蛋白表达水平各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平组间比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组、LncRNA-ATB-NC组和LncRNA-ATBshRNA组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB蛋白表达水平均升高（P＜0.05）；与模型组和LncRNA-ATB-NC 组比较，LncRNA-ATB-shRNA组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平均降低（P＜0.05）；模型组与LncRNAATB-NC组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6 和图2。

表6 各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平Tab.6 Expression levels of TLR4,MyD88,and NF-κB proteins in kidney tissue of rats in various groups（）

表6 各组大鼠肾组织中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平Tab.6 Expression levels of TLR4,MyD88,and NF-κB proteins in kidney tissue of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with LncRNA-ATB-NC group.

3 讨论

图2 各组大鼠肾组织中NF-κB、MyD88 和TLR4 蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB，MyD88，and TLR4 proteins in kidney tissue of rats in various groups

ERSD 是全球范围内重大公共卫生问题，随着肾移植的逐渐推广，部分患者得到了有效治疗，但术后AR 仍然是一个不可忽视的问题，其不仅是造成移植肾失功的危险因素，同时也严重影响移植肾的长期存活。随着免疫抑制剂的不断出现和改进，器官移植排斥反应发生率明显下降，但大量使用免疫抑制剂会给患者带来不良反应［6］。因此，探讨移植免疫相关的分子机制对肾移植AR 早期诊断和治疗具有重要意义。LncRNA 和miRNA 是最重要的2 类非编码RNA，均在基因表达调控中起着关键作用。多项研究［7-9］表明：器官移植后LncRNA 在免疫排斥受体体内异常表达，可以利用LncRNA 作为早期诊断受体对同种异体移植物产生AR 的标志物。既往研究［10-12］表明：LncRNA 可作为内源竞争性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与miRNA 直接结合，从而抑制miRNA 的活性，调控下游信号通路，进而影响疾病发展。研究［13］显示：LncRNA-ATB 与miR-200s 也存在上述相互作用，LncRNA-ATB 可以与miR-200s 结合，抑制miR-200s 的表达，促进细胞增殖、迁移和侵袭。

本研究采用同种异体大鼠建立肾移植AR 模型，与假手术组比较，模型组大鼠外周血LncRNA-ATB 表达水平明显升高，表现出AR 典型病理变化，经shRNA 干扰载体沉默LncRNAATB 后，LncRNA-ATB-shRNA 组大鼠外周血中LncRNA-ATB 表达水平、AR 半定量评分及血清中Scr 和BUN 水平明显降低，肾组织AR 病理形态改变减轻，提示肾移植AR 大鼠LncRNA-ATB 异常升高，可能参与AR 发生发展过程，沉默LncRNAATB 后可减弱肾移植后AR 的发展。研究［14］表明：在肾移植术后AR 受体肾组织切片中LncRNAATB 表达水平明显高于对照组，促进供体器官炎症反应。QIU 等［15］在对肾移植AR 患者和对照肾移植患者的肾脏活检组织中检测到LncRNA-ATB表达，AR 患者LncRNA-ATB 表达水平较对照组明显上调，与本研究结果类似，进一步提示LncRNA-ATB 可能参与大鼠肾移植术后AR 进展，沉默LncRNA-ATB 有利于减弱AR 发展，减轻肾功能损害。

本研究结果显示：与模型组比较，LncRNAATB-shRNA 组大鼠外周血中miR-200c 表达水平明显升高，提示LncRNA-ATB 可能参与调控miR-200c 在肾移植大鼠中的表达。刘易［16］研究发现：LncRNA-ATB 参与调控 miR-200c 的表达，LncRNA-ATB 可以作为ceRNA 竞争性结合miR-200c 促进肺上皮细胞纤维化。赵伟等［17］研究显示：LncRNA-ATB 与miR-200c 竞争性地调控其下游通路发挥对miR-200c 的调控作用。本研究与上述研究结果一致，表明LncRNA-ATB 与miR-200c在疾病发生发展过程中有关联。miR-200c 是一种能够抑制炎症反应的miRNA，与TLR4 信号通路关系密切。TLR4 信号通路与炎症反应密切相关，在依赖MyD88 途径中，通过活化的结构域与MyD88 结合，释放NF-κB，活化下游炎症因子（IL-6、IL-8 和TNF-α 等），促进炎症反应。过表达miR-200c 可抑制TLR4 信号通路，下调MyD88 表达，阻断NF-κB 活化，降低IL-6 和TNF-α 表达［18］。既往研究［19］显示：miR-200c 可以通过改变NF-κB 活性来调节IL-8 表达，过表达miR-200c 可以降低IL-8 表达。在口腔鳞状细胞癌中，NF-κB激活的同时伴有促炎miRNA 表达水平升高及miR-200c 表达抑制［20］。本研究中经shRNA 干扰载体沉默LncRNA-ATB 后，大鼠外周血中miR-200c表达水平明显升高，IL-6、IL-8 和TNF-α 水平，TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 及蛋白表达水平均降低，提示沉默LncRNA-ATB 可能通过上调miR-200c 表达抑制TLR4/MyD88 信号通路发挥抗炎作用。

综上所述，在大鼠肾移植后，沉默LncRNAATB 可发挥抑制AR 及炎症反应发生作用，其机制可能是通过上调miR-200c表达，阻断下游TLR4/MyD88 信号通路，进而减弱AR 发展，抑制受体组织炎症反应，本研究结果为临床早期诊断和治疗肾移植术后AR 提供一定理论依据。