胶原海绵与脱细胞基质在大鼠体内的降解过程

马 也， 赵磊磊， 高建萍， 孔英俊， 张贵锋， 刘 涛

(1. 广东药科大学 生命科学与生物制药学院， 广州 510000； 2. 中国科学院 过程工程研究所 生化工程国家重点实验室， 北京 100190； 3. 河北考力森生物科技有限公司， 邯郸 057450)

胶原作为细胞外基质的主要成分主要存在于动物的结缔组织中，是哺乳动物体内含量最多的蛋白。胶原具有生物可降解性及生物相容性，特殊的三螺旋结构使其具有一定的机械强度和可塑性，因此广泛用于生物材料和再生医学领域[1-2]。脱细胞基质是通过物理或化学等方法将组织内的细胞成分去除仅保留含胶原三维结构的细胞外基质，其主要成分是不同类型的胶原，同时还包含少量纤维连接蛋白、层黏蛋白以及微量或痕量的生长因子和细胞因子等,这些成分含量和特性相对稳定[3-4]。近年来，胶原和脱细胞基质作为重要的生物材料日益引起广泛关注，其体内降解过程是影响材料应用的关键。在进行体内植入后若降解过快，在一定时期内力学强度急剧下降,而此时成纤维细胞产生的细胞外基质达不到自体组织的要求，降解过慢则会影响组织的再生修复并引发排异、包裹等免疫反应。因此研究胶原基生物材料的体内降解过程,对于提升降解过程与受体的自体组织形成过程协调性，保证组织形成前保持材料特性并使其在组织形成后自行降解具有重要意义[5-8]。

胶原基材料在体内降解的研究远少于体外。樊立涛等通过新西兰兔腹壁植入实验观察脱细胞猪皮基质材料的降解情况，以目测材料的降解程度，此方法仅能粗略估计降解周期，无法准确定量[9]。覃广兵等通过桡骨缺损区X射线观察不同时间点材料的降解情况，相比直接取出材料更加便捷，而且能保持材料在体内的形态与结构，直接观察体内材料的降解程度，但此方法同样无法定量[10]。张楠等在微弧氧化涂层镁合金替代骨缺损修复的体内降解实验中于4、8和12周取出材料，通过剩余植入物体积来定量降解残留，由于此材料机械强度高，且在体内降解过程中受到组织间影响较少，所以此方法可较准确定量且现阶段大部分表征体内降解周期都是运用此方法，但胶原基材料在体内降解过程中存在组织包裹较多、材料机械强度低、可塑性差、无法完全剥离组织与材料等情况，运用该方法存在较大误差[11]。郭永伟等在研究不同孔径的再生丝素蛋白支架的体内降解实验中通过传统的石蜡和苏木精伊红(H&E)染色，通过图像助手软件进行定量分析。但在做组织学切片的过程中会造成无法完全染色，而且在拍照的时候即使选择阳性区域与阴性区域的混合也难以代表整个切片，所以此方法仅适用于半定量[12]。

本研究针对胶原基材料的特性，拟建立一种基于高效液相色谱-质谱联用技术对材料中的特征多肽GEGGPQGPRG定量来表征材料在大鼠体内降解过程的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

10周龄SD雄性大鼠21只，体质量200～250 g，实验动物(合格证号：NO.1103241911012185)购自北京通和立泰生物科技有限公司。

胶原海绵为河北考力森生物科技有限公司提供，脱细胞基质材料由烟台正海生物科技股份有限公司提供。

胰蛋白酶(序列纯)购自美国Promega公司；特征多肽GEGGPQGPRG由上海强耀生物科技有限公司提供；高效液相色谱-质谱联用系统(HPLC-MS)由美国Agilent公司 1100液相色谱和美国Thermo Fisher公司LCQ DecaXP电喷雾质谱组成，数据采集与处理软件为Xcalibur 1.3；液相色谱-三重四级杆质谱联用系统由美国Thermo Fisher公司U3000液相和TSQ Quantum ACCESS MAX质谱组成，数据采集与处理软件为Xcalibur 1.3；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 胶原海绵和脱细胞基质体内埋植实验

将两种材料切成规格1 cm×1 cm，将所选SD大鼠随机均分为3组，麻醉后，剔除背部被毛，碘酒消毒，手术沿脊柱切开皮肤，切口长约5 cm，实验组A在鼠脊柱两侧约2 cm处等距离各选1个植入点分别皮下植入胶原海绵与脱细胞基质，分离皮下组织与筋膜，缝合线缝合材料与皮下筋膜，最后缝合背部皮肤，创口用碘酒消毒，埋植情况如图1-a。实验组B、C与A实施同样手术。实验后连续3 d每只注射青霉素50 000 U/(kg·d)，以防感染。术后观察创面愈合情况，术后0、1、2、4、6、8、12和16周每次分别从3组中取材1只，颈椎脱臼处死，尽量分离皮下筋膜与材料，取材后冷冻干燥并称重每一时间点材料建立降解率曲线并观察埋植部位材料的吸收降解情况。

1.2.2 特征多肽筛选实验

称取牛胶原海绵1 mg，加入0.05 mol/L NH4HCO3(pH 8.0)缓冲液400 μL于100 ℃水浴中热变性处理15 min，取出冷却至室温，加入20 μg胰蛋白酶与600 μL缓冲液于37 ℃下酶解18 h，酶解产物离心10 min，10 000 r/min上清液进行HPLC-MS分析，分析结果通过Sequest数据库筛选肽段。

离子阱质谱(Ion Trap Mass Spectrometry, LCQ)条件如下，色谱柱：Zobarx SB C18 (150 mm×2.1 mmI.D，5 μm)；流动相A:水(含0.1%三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1% 三氟乙酸)；梯度：0～80 min，5%～50%流动相B，80～90 min，50%～90%流动相B，90～100 min，90%～90% 流动相B；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：50 μL。多肽筛选质谱条件：ESI电喷雾离子源，喷雾电压4.5 kV，加热电压15 V，离子导入电压(Skimmer电压)20 V，鞘气流速19.8 mL/min，辅助气流速5 psi，离子传输毛细管温度300 ℃。当筛选特征多肽时离子的监测模式参数中设立3个Scan event，Scan event1为一级质谱全扫描，扫描范围m/z 300～2000，正离子监测Scan event 2和3为数据依赖型精确质量数扫描和二级质谱的扫描均采用全扫描模式。

1.2.3 特征肽定量检测实验

从0、2、4、6、8、12和16周分别取样冷冻干燥后分批次酶解前处理同1.2.2方法，后上清液进HPLC-MS分析

三重四极杆质谱(Triple quadrupole mass spectrometry, TSQ)条件如下，色谱柱：Zorbax SB C18 (150×2.1 mmI.D.，5 μm)；流动相A：水(含0.1%甲酸)，流动相B：60%乙腈(含0.1%甲酸)；梯度：0～35 min，5%～100% 流动相B；进样量10 μL；流速0.2 mL/min。质谱条件：离子源喷雾电压4.5 kV，毛细管温度300 ℃，扫描范围m/z 300～2000。选择离子扫描，特征多肽m/z 854.42是单电荷离子，m/z 427.71 是双电荷离子。

2 结果与分析

2.1 材料降解分析

胶原海绵呈乳白色状，质地较软，韧性较低(图1-b)。脱细胞基质呈白色，质地较硬，韧性较高，更为致密(图1-f)，2周后胶原海绵轮廓有明显变形，材料可见。材料与组织间未形成包裹，组织周围未发现红肿，无明显免疫炎症反应(图1-c)。2周后脱细胞基质轮廓无明显变化，材料仍清晰可见，材料与组织间可轻易分离，组织周围未发现红肿、包裹等明显免疫炎症反应(图3-g)。4周后胶原海绵轮廓可见但已丧失基本形态，材料隐约可见，致密度明显变低，降解后的材料碎裂成块状，组织与材料间无明显免疫炎症反应(图1-d)。4周后脱细胞基质轮廓有明显变形，材料仍清晰可见，材料与组织筋膜间形成粘连，材料开始进入肉眼可见的降解阶段，无明显免疫炎症反应(图3-h)。6周后胶原海绵材料完全与筋膜重叠，仅能通过缝合线位置判断材料位置，无明显免疫炎症反应(图1-e)。6周后脱细胞基质轮廓渐不规则，但材料仍清晰可见。材料本身厚度明显变薄，机械强度明显下降，已逐渐被受体组织吸收，覆盖，无明显免疫炎症反应(图3-i)。8周后脱细胞基质轮廓逐渐丧失基本形态，材料可见，致密程度降低，部分材料降解已暴露出组织，无明显免疫炎症反应(图1-j)。12周后脱细胞基质材料隐约可见，材料已无规则形状，完全贴附在组织筋膜上，难完全分离，未降解部分碎裂，变薄，致密程度大幅降低(图3-k)。16周后脱细胞基质材料不可见，仅能通过缝合线位置判断材料位置(图3-l)。可见胶原海绵6周降解较为完全，脱细胞基质16周降解较为完全。

2.2 失重法降解过程分析

两种材料不同时间点取样，样品冷冻干燥称重。胶原海绵0周(8.6±0.2) mg,1周(7.3±0.4) mg，2周(6.2±0.4) mg，4周(2.1±0.9) mg，6周(0±1.2) mg。脱细胞基质0周(14.5±0.1) mg，2周(12.7±0.3) mg，4周(8.9±0.4) mg，6周(6.8±0.2) mg，8周(4.2±0.4) mg，12周(0.2±1.5) mg，16周(0±1.9) mg。胶原海绵2～4周降解速度最快，6周时已无法分离材料间组织，与筋膜完全重叠，称量误差较大，质量趋近于0。脱细胞基质材料2～4周降解速度最快，4～12周趋于平稳，但16周后材料已经完全碎裂成小块，称量误差较大，质量趋近于0。由此得出结论胶原海绵降解周期为6周，脱细胞基质降解周期为16周。失重法体内降解曲线如图2。

a：体内埋植示意图；b-e：胶原海绵0、2、4和6周降解示意图；f-l：脱细胞基质0、2、4、6、8、12和16周降解示意图

图2 失重法体内降解曲线

2.3 特征肽筛选实验

胶原海绵主要成分为牛I型胶原，胶原经胰酶酶解处理后产生大量低分子量的多肽肽段，筛选肽段应符合以下条件：多肽质谱信息用sequest软件进行数据库检索，当搜索结果用如下参数进行过滤时，所产生的肽段被认为是阳性结果，即当多肽带1个电荷(charge=1)时，Xcorr>1.5；带2个电荷(charge=2)时，Xcorr>2.0；带3个电荷(charge=3)时，Xcorr>2.5。多肽分子量在2000 u以下，分子量过大，二级碎片离子过多，造成数据库检测不准确。羟基化修饰位点少。最低检测限可被检出且多肽丰度高[13]。按以上条件筛选得到特征多肽候选肽段见表1。

表1 所选特征多肽候选多肽段信息

P1、P2发生羟基化修饰过多不利于定量。对P3进行HPLC-MS分析，m/z 854.42是单电荷离子，m/z 427.71 是双电荷离子，与带单电荷离子相比，离子m/z 427.71 的二级质谱图中的碎片离子信号强度较高，更易被检测出。P3肽段 GEGGPQGPR 肽链短小，分子量适合，无羟基化修饰，且为牛源特征肽，不存在于大鼠中。提取离子流图与一级质谱图(图3)，二级质谱图(图4)结果与理论值匹配度较高，可用作特征肽段。

图3 特征多肽GEGGPQGPR提取离子流图和一级质谱图

图4 特征多肽GEGGPQGPR二级质谱图

2.4 特征肽浓度与信号强度关系

图5为不同浓度特征多肽GEGGPQGPR的提取离子流图，线性回归曲线(y=2178.3x-0.2438，R2=0.999)，线性关系良好。

2.5 胶原海绵与脱细胞基质体内降解曲线

将0、2、4、6和8周胶原海绵样品与0、2、4、6、8、12及16周脱细胞基质样品按1.2.2方法处理后进HPLC-MS分析，分别将峰面积带入标准曲线得到脱细胞基质0周特征肽浓度(4.20±0.10)×10-3mg/mL，2～4周降解速度最快，8周后趋于平缓，16周时特征肽浓度(1.30±0.11)×10-5mg/mL趋近于0 mg/mL判断已基本完全降解。胶原海绵0周特征肽浓度(2.79±0.09)×10-3mg/mL，同样2～4周降解速度最快，4周后趋于平缓，8周时特征肽浓度(0.40±0.10)×10-5mg/mL，趋近于0， 判断已基本降解。两种材料降解曲线见图6。

图5 不同浓度特征多肽GEGGPQGPR提取离子流图

图6 胶原海绵与脱细胞基质体内降解曲线

3 讨论与结论

胶原基材料常用于组织工程领域，随着临床需求量的增加，出现过部分副反应，如肠梗死、肠瘘、腹壁粘连等，经研究发现与材料降解率有关[14]，因此研究其降解规律极其重要。本研究通过对胶原基材料的降解过程进行研究，对每一时间点材料降解程度进行准确定量，以期为其在受体内的降解时程提供依据，使其降解过程与受体组织自愈过程相协调来符合临床应用的基础要求[15]。

目前研究胶原基材料的体内降解周期还主要依赖于宏观观察、Micro-CT扫描观察、材料降解丢失体积、H&E染色法及同位素标记法等[10,12,14,16]。本实验中运用的特征肽法是针对于胶原基材料特有的特征多肽进行定量，此多肽仅存在于材料中而不存在于受体实验动物中，故实验动物及其植入部位周围组织不会对定量产生影响，因此该方法对胶原基材料在降解过程中受到受体动物的组织覆盖、包裹的干扰很小。此外，针对不同动物源的胶原基材料都可以实现准确定量，精密度高。本实验中，我们选择胶原海绵与脱细胞基质材料作为研究对象，通过宏观观察体内降解周期得出结论：胶原海绵6周几乎降解完全，脱细胞基质16周几乎降解完全，但是材料的降解规律无法得到。体内降解失重实验中，胶原海绵0～2周降解速率缓慢；而2～4周的体内降解速率明显高于其他时间点；4～6周减缓，称重误差较大；第6周几乎完全降解，胶原海绵降解周期基本为6周。脱细胞基质0～2周降解缓慢；2～4周降解速率最快；4～8周速度减缓；12和16周称重误差较大；第16周几乎完全降解，其降解周期基本为16周。特征肽法实验中，胶原海绵与脱细胞基质的降解趋势同失重法，但能准确定量降解后期两种材料的残留特征肽浓度，由此得出胶原海绵降解周期8周，脱细胞基质降解周期16周。通过对比3种方法确定特征肽法更适用于胶原基材料体内降解周期的定量。

综上所述，本研究所建立的特征多肽法不受材料形式限制，还可应用于膜、补剂等胶原基材料[17-18]，能准确定量，精确度高。此外，该方法还可以根据材料的应用需求，通过胶原基材料间的交联来调控降解周期，以期达到与实际应用相匹配的效果。还可应用在可生物降解的人工神经导管、无定形材料水凝胶、胶原基材料补片、胶原蛋白复合支架等[19-22]。