诱导子在药用植物毛状根生产次生代谢产物中的作用机理与应用

齐敏杰， 梁 娥 ， 张 来

(1. 贵州师范大学 生命科学学院， 贵阳 550000; 2. 安顺学院 功能材料与资源化学贵州省高校特色重点实验室， 安顺 561000； 3.中国科学院 昆明植物所， 昆明 650201)

次生代谢产物是药用植物的主要药用成分，目前通过细胞悬浮培养[1]、愈伤组织培养[2]、根细胞培养[3]来调控药用植物次生代谢产物的积累已有相关报道。20世纪80年代出现的毛状根培养技术是生产次生代谢产物的有效途径[4]；毛状根是发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA片段被整合到寄主植物细胞的核基因组中而产生的[5]。笔者所在团队研究并总结了药用植物毛状根的培养与应用，掌握了毛状根具有生长速度快、激素自养和遗传性状相对稳定等优点[6]，并对药用植物竹节参进行毛状根诱导，成功培养了竹节参毛状根单克隆体系，为极稀少的竹节参生产皂苷开辟了一条不依赖原植物体的全新有效途径[7]；同时对竹节参正常根及毛状根中精油成分进行了比较分析[8]。诱导子(Elicitor)能快速专一地诱导植物体内关键酶基因表达从而导致特定次生代谢产物的积累，这对研究和利用药用植物特定药用成分提供了新的思路和策略。

1 诱导子

当受到某种因子刺激时，植物细胞易合成具有抵抗这种因子活性的次生代谢产物，这种因子就是诱导子。

1.1 诱导子的分类

根据来源的不同，诱导子可分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子是来源于微生物或动植物细胞中的物质，主要是真菌孢子、细胞壁碎片和真菌丝等；非生物诱导子不是植物细胞中的天然成分，却可以使植物产生防御化合物，主要有化学诱导子和物理诱导子两类。常用的化学诱导子有植物生长调节剂(Plant growth regulators)、水杨酸(Salicylic acid, SA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MJ)等；紫外线辐射、高低温和溶氧量为物理诱导子。

1.2 诱导子的作用机理

关于诱导子的作用机理研究较少，目前大家普遍接受的是：诱导子作为外源信号被细胞膜上受体识别并结合，增强细胞膜的通透性和流动性(Ca2+、H+内流和 Cl-、K+外流)；然后细胞内的第二信使(G蛋白、磷酸肌醇、cAMP等)把信号传递至细胞核；最终激活特异性基因，从而调节次生代谢产物合成(图1)[9]。诱导子通过调节关键酶基因的表达来调控次生代谢产物的积累，因此找到诱导子对植物体内次生代谢产物的合成积累影响过程中的影响因子具有重要意义。如经过诱导子处理的烟草叶片中苯丙氨酸解氨酶活性增强，使多酚积累量增加[10]。经过flg22诱导处理的拟南芥幼苗，在吲哚族芥子油苷核心结构形成过程中CYP83B1和CYP79B2的表达水平显著提高，芥子油苷积累量增加[11]。MJ的加入使菘蓝毛状根中CHI和F3′H基因的表达水平上调，进而促进其黄酮类次生代谢产物积累[12]。刘佳和吴能表[13]研究发现，与对照组相比，不同浓度的AgNO3均能提高pmt、trI和h6h基因的表达，从而增加托品烷类生物碱的积累量。

图1 药用植物次生代谢产物生物合成的信号转导网络模型[9]

2 不同类型的诱导子在药用植物毛状根生产次生代谢产物中的应用

利用诱导子来促进次生代谢产物的积累已成为毛状根次生代谢产物生产过程中的主要方法之一，目前已经在人参、颠茄、紫草和丹参等多种药用植物中有相关报道。在研究诱导子对植物代谢影响的过程中，浓度效应和时间效应调控的研究成为人们关注的焦点。浓度效应是指不同浓度的诱导子其作用效果存在差异，特定的浓度能使次生代谢产物的积累量达到最高值；时间效应是指在植物适应自身生长环境之后加入诱导子使得次生代谢产物积累量最大化，不同植物对时间效应的反应速度存在差异，而不同植物的适应能力也有所差异，因此需要逐步试验和摸索。根据笔者所掌握的文献资料对诱导子在药用植物毛状根中生产次生代谢物质的研究和利用进行归纳和整理。

2.1 生物诱导子在药用植物毛状根生产次生代谢产物中的应用

近年来，在毛状根培养的基础上加入生物诱导子来调控次生代谢产物积累的研究应用较广。酵母提取物(YE)是常用的生物诱导子之一。刘佳等[14]使用YE诱导颠茄毛状根生长，发现一定浓度的YE既能增加颠茄毛状根的积累又能提高托品烷类生物碱含量。以浓度为100 mg/L 的YE 作用于颠茄毛状根培养至16 d，莨菪碱和东莨菪碱的产量分别是对照组的3.09 倍和 1.85 倍[15]；以浓度为50 mg/L的YE处理的西洋参毛状根中人参总皂苷含量是对照组的1.57倍[16]。有学者研究指出霉菌也是较为常用的生物诱导子之一。如在黑曲霉和米曲霉浓度较低时均能促进新疆紫草毛状根中萘醌的积累[17]；以浓度为 40 mg/L的黑曲霉和20 mg/L的米曲霉处理黄芩毛状根，使黄芩苷积累量增加了1.54%和1.17%[18]；阎岩[19]以4%的密旋链霉菌Act12的发酵液和菌丝体混合液处理丹参毛状根，发现总丹参酮积累量最高为对照组的12.6倍。细菌作为诱导子的研究相对较少，仅见零星报道。尤红[20]研究发现野生丹参内生细菌是诱导其毛状根中丹酚酸积累效果最好的菌株；也有学者发现用0.2%的蜡样芽孢杆菌处理丹参毛状根时，总丹参酮积累量是对照组的13倍[21]。

2.2 化学诱导子在药用植物毛状根生产次生代谢产物中的应用

在药用植物毛状根培养体系中，诸多研究者常用植物生长调节剂、酯类、酚类和金属盐等化学诱导子来促进次生代谢产物的积累。虽然毛状根具有激素自养的优点，但研究发现，植物生长调节剂能促进毛状根中次生代谢产物的积累。如在添加1 mg/L NAA和 1 mg/L BA的情况下，酸浆果毛状根的澳洲茄胺甙含量是不加激素的 2.6 倍多[22]。李春玲[23]研究发现加入0.5 mg/L NAA培养时，水飞蓟毛状根中水飞蓟宾积累量是对照的1.6倍。MJ可以提高某些特定次生代谢产物含量。熊丙全等[24]在丹参毛状根的培养液中加入MJ，发现MJ能显著提高丹参毛状根中丹参酮的积累。添加MJ能增加甜叶菊毛状根中绿原酸类物质含量，而添加SA则不能[25]。王瑜[26]研究指出，在王不留行毛状根培养18 d时，分别加入150 μmol/L MJ和20 mg/mL SA继续培养，则黄酮苷的积累量最高可达到对照组的5.32和3.78倍。低浓度的SA能明显促进水飞蓟毛状根中水飞蓟宾积累[23]。

多数研究发现，金属盐作为诱导子对药用植物毛状根次生代谢产物的积累也有促进作用。如当诱导子AgNO3浓度5 mg/L时，新疆紫草毛状根中的紫草素、总多酚以及总黄酮的含量都比对照组高[27]；AgNO3的加入虽然抑制了颠茄毛状根的生长，却增加托品烷类生物碱的积累量[13]；在丹参毛状根培养中也有类似现象，即 Ag+在增加丹参毛状根中迷迭酸、咖啡和阿魏酸的积累量的同时抑制了丹参毛状根的生长[28]。有研究指出，在天仙子毛状根培养液中加入50 μmol/L硝普钠后培养48 h时，发现毛状根中东莨菪碱积累量达到最高值并且在对照的基础上增加了1.2倍[29]；加入100 μmol/L硝普钠后培养24 h时，则毛状根中天仙子碱积累量达到最高值并且在对照的基础上增加了1.5倍。

2.3 物理诱导子在药用植物毛状根生产次生代谢中的应用

温度、光照、溶氧量等物理诱导子对药用植物毛状根次生代谢也有一定调控和影响作用，在三分三、高丽参、雪莲、黄芪、苦荞、青蒿等植物毛状根培养中已有报道。

毛状根一般的生长温度是20 ℃～25 ℃，但是不同的药用植物毛状根产生次生代谢产物的最适温度是不同的。如三分三在25 ℃培养条件下毛状根中莨菪碱含量最高，是35 ℃的2.70倍[30]；高丽参毛状根生物量以及人参皂苷产量在20 ℃/ 13 ℃[日(12 h) / 夜(8 h)]循环下达到最大值[31]；水母雪莲毛状根在24 ℃的培养条件下，毛状根的生长及总黄酮产量均达到最大值[32]。

一些研究表明，光照对毛状根生长与合成产物的影响随着植物种类的不同而有所差异[33]。光质和光照强度都会对次生代谢产物合成和积累产生影响。紫外线辐射已被证明是一种用来刺激植物次级代谢产物积累的有效诱导子。焦娇[34]研究了紫外线(UV-A、UV-B、UV-C)对黄芪毛状根次生代谢产物异黄酮和皂苷积累的影响，检测发现UV-B辐射量在86.4 kJ/m2时，总异黄酮产量是对照组的2.29倍；为54 kJ/m2时，总皂苷产量是对照组的1.30倍。Huang等[35]对苦荞麦毛状根进行UV-B胁迫处理发现芦丁积累量显著增加，是对照组的5.18倍；但是槲皮素的积累量仅为对照组的2倍。Yu等[31]研究了6种不同光照条件对人参毛状根中人参皂苷积累的影响，发现在荧光灯下的毛状根中的人参皂苷积累量增加最多。光照条件为3500 lx(18 h/d)时, 雪莲毛状根中总黄酮积累量比全黑暗时增加了1.6倍, 仅比全光照时增加了0.2倍[32]。

溶氧量对植物毛状根次生代谢产物积累也有一定的影响。如青蒿毛状根在装有50 mL培养液的250 mL锥形瓶中培养时，其生长量和青蒿素的积累量均达到最大值[36]。在转速为100 r/min条件下摇床培养水母雪莲毛状根，具有较高溶氧量使毛状根生长量和总黄酮积累量均达到最大值[32]。张丹[37]研究发现当摇床培养的转速为130 r/min时，人参毛状根鲜重和阜苷积累量均达到最大值。

2.4 诱导子协同作用在药用植物毛状根次生代谢产物中的应用

诱导子的协同作用是指在诱导子之间存在一定的混合比例对植物毛状根中次生代谢产物积累的影响效果。目前研究较多的是MJ和SA组合、YE和Ag+组合以及植物激素和其他化学诱导子组合。在人参毛状根培养液中同时加入0.001 mmol/L MJ和SA，其皂苷含量比二者单独作用都要高[38]。100 μmol/L MJ和SA组合是促进雷公藤发状根中吉碱和次碱总产量积累的最佳组合，分别为对照组的5.33和8.56倍[39]。100 mg/L YE和300 μmol/L Ag+组合处理丹参毛状根时，使丹参酮Ⅰ的积累量达到最大值，是对照组的13.9倍[40]。也有学者研究了YE和Ag+组合对丹参毛状根中丹参酮类积累的影响，结果显示隐丹参酮积累量达到最大值时为同时期对照组的41.1倍，丹参酮ⅡA积累量达到最大值时为同时期对照组的7.4倍[41]。在植物激素和其他化学诱导子组合研究方面，有学者用0.5 mg/L NAA和1.0 mg/L KT组合、100 μmol/L MJ和30 μmol/L SA组合以及0.5 mg/L NAA和30 μmol/L SA组合均能促进圆叶牵牛毛状根中咖啡酸和咖啡乙酯的积累，3个组合中0.5 mg/L NAA和30 μmol/L SA组合能使咖啡酸和咖啡乙酯积累量达到最大值[42]。

3 诱导子在药用植物毛状根次生代谢产物中的应用前景

随着人们对天然药物的高度关注和认可，其供不应求的现象日益凸显，虽然化学合成方法也有一定的效果，但其工艺流程复杂，成本较高，易造成环境污染；而诱导子对药用植物毛状根次生代谢产物的积累具有显著作用；因此利用诱导子调控药用植物毛状根次生代谢产物合成已成为一个新的研究热点。

目前虽然对大多数诱导子的作用机制不明确，但是利用诱导子作用于药用植物毛状根来促进次生代谢产物积累的技术迅猛发展并得到大规模应用，在毛状根培养液中添加诱导子高效快速地促进次生代谢产物积累已经显现出乐观的应用前景，这不仅提高了药用植物次生代谢产物的产量，还降低了生产成本、取得可观的经济效益。这些研究为综合利用诱导子生产药用成分提供了科学案例和实验方案。