短期禁食和重喂食对不同地区大绒鼠下丘脑神经肽表达量和行为的影响

任晓英, 刘春燕, 侯东敏, 朱万龙

(1. 云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室 云南师范大学 生命科学学院, 昆明 650500； 2. 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心, 昆明 650500； 3. 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室， 昆明 650500； 4. 中国科学院 昆明动物研究所， 昆明 650223)

表型可塑性是动物对生态环境和生理状态变化的反应[1]。食物在动物种群调节中发挥着重要作用，许多啮齿类动物应对食物短缺时会采取一些适应策略，如休眠、囤积食物或增加觅食活动[2]。不同啮齿类动物在维持食物短缺的适应可能是不同的，如限食使长爪沙鼠体重降低且动用体脂[3]。然而，限食条件下小鼠通过减少静止代谢率和活动支出的能量来防止体重下降，而不是通过动用体脂[4]。瘦素作为脂肪细胞分泌的信号分子，可作用于下丘脑调节动物的食欲[5]。研究表明禁食会导致大鼠瘦素水平下降，重喂食后又可以恢复[6-7]。瘦素可以作用于下丘脑影响摄食神经肽Neuropeptide Y(NPY)、Agouti related peptide(AgRP)、Pro-opiomelanocortin(POMC)、Cocaine and amphetamine regulated transcript Peptide(CART)等的表达与合成，从而控制动物的食欲和能量消耗[8-10]。瘦素浓度的增加会抑制NPY/AgRP合成代谢通路，刺激POMC分解代谢通路，导致动物摄食量减少[11]。食物限食会导致瘦素浓度降低，NPY的表达量增加[12]。长期饥饿也会使大鼠下丘脑NPY的含量增加[13]，而限食后重喂食会引起血清瘦素浓度升高，下丘脑NPY基因表达下降[14]。食物限制还会使动物AgRP含量显著增加，POMC和CART含量显著降低[15-16]。此外，禁食也使大鼠和小鼠CART表达下降[17-18]。

当环境发生变化时，动物通常会改变它们的活动模式。研究表明在食物短缺时，西伯利亚仓鼠觅食和囤积食物行为显著增加，限食使大鼠及其他啮齿类动物的轮跑活动增加[19]。此外有研究证明，限食Mesenchyme forkhead 1(MF1)小鼠活动性和能量支出增加，导致体重和体脂下降[20]，限食也会使自由轮转条件下大鼠活动行为显著增加[21]。相反，限食大鼠在24 h内休息行为增加，其活动行为降低[22]。

横断山区位于中国西南部，生态系统复杂多样。大绒鼠(Eothenomysmiletus)为中国特有种，是横断山区的典型代表和固有类群[23-25]。该地区干湿季节分明，冬天无冰雪覆盖，故食物资源相对丰富。本课题组先前对横断山不同地区大绒鼠体重调节进行了研究，结果证实了不同地区大绒鼠受温度和海拔的影响较大[26]。此外，禁食会导致大绒鼠一些生理指标显著变化[27]。然而关于禁食对异域分布大绒鼠生存适应的影响尚不清楚。作者在先前研究的基础上，选取了表型差异显著的香格里拉和剑川地区的大绒鼠作为实验对象，在禁食12 h、24 h和禁食36 h后重喂食7 d条件下，测量大绒鼠的体重、摄食量、瘦素含量、下丘脑神经肽表达量和活动行为的变化，探讨不同生境大绒鼠遭遇食物不足时其生理调节以及行为差异，最终来了解该动物在短期饥饿胁迫环境下的生态对策。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物2017年11月捕获于横断山区香格里拉(99°83′16″E，27°90′30″N)和剑川县(99°75′03″E，26°43′95″N)两地，海拔分别为3450 m和2590 m，香格里拉地区冬季气候冷凉，在冬季食物资源相对匮乏。剑川地区气候温凉，农作物为一年两熟，故可利用的食物较丰富。将香格里拉和剑川地区捕捉到的大绒鼠带回云南师范大学生命科学学院(昆明)动物饲养房，单独被安置在塑料盒(260 mm×160 mm×150 mm)，无巢材，喂以浸泡过的玉米和一些瓜果，自由饮水，在室温(25 ℃±1 ℃)和光周期下(12 L∶12 D)环境下驯化适应。所有动物程序均符合云南师范大学生命科学学院动物伦理委员会的相关规定(13-0901-011)。

1.2 实验方法

1.3 体重、摄食量和活动行为的测定

体重、摄食量及行为活动的测定均采用小型哺乳动物代谢系统(PRO-MRMR-8，Sable Systems International Inc，美国)。小型哺乳动物代谢笼装有体重、水瓶和食物盒，与装载单元相连，用于体重、摄食量的监测。每天早上9:00开始记录，每隔5 min进行记数。最后利用数据分析系统(SW-METASCREEN，Sable Systems promethion)进行分析数据。体重、摄食量和活动行为的数据记录和仪器控制通过Meta Screen.v.1.6.2记录。

1.4 瘦素含量和下丘脑神经肽表达量测定

血清瘦素含量采用瘦素放射免疫分析试剂盒(美国 Linco 公司生产)测定。大绒鼠的下丘脑总RNA参照高纯总RNA快速抽提试剂盒(BioTeke Co.生产)提供的方法进行提取与纯化。NPY、AgRP、POMC和CART基因cDNA核心序列的扩增和表达量的定量方法详见Zhu等[28]研究报道。

1.5 数据统计

用SPSS22.0统计软件对数据进行分析。在进行所有统计分析之前，分别使用Kolmogorov-Smirnov和Levene检验，检验数据的正态性和方差同质性假设。性别对所有测定指标影响不显著，因此数据合并使用。采用双因素方差分析体重的差异，摄食量、血清瘦素含量、下丘脑神经肽基因表达量和活动行为的差异采用双因素协方差分析，以体重作为协变量，组间差异采用Tukey多重比较分析法。结果以平均值±标准偏差表示，P<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 体重、摄食量和活动行为

地区和食物处理极显著影响了大绒鼠的体重(地区：F3,40=4.81，P=0.034；食物：F1,40=6.27，P=0.001，图1)，两者的交互效应差异不显著(F3,40=0.12，P=0.950)。地区处理极显著影响了大绒鼠的摄食量(F1,39=20.20，P=0.010)，但是食物处理和两者的交互效应对大绒鼠的摄食量影响不显著(食物：F3,39=0.01，P=0.956；交互效应：F3,39=1.20，P=0.275；图2)。地区、食物处理和两者的交互效应极显著影响了大绒鼠的活动行为(地区：F1,39=10.78，P=0.001；食物：F3,39=106.83，P=0.000；交互效应：F3,39=14.96，P=0.000，图3)。

柱上不同字母表示组间差异显著(P<0.05)；下同

图2 短期禁食和重喂食对两地区大绒鼠摄食量的影响

图3 短期禁食和重喂食对两地区大绒鼠活动行为的影响

2.2 短期禁食和重喂食对不同地区大绒鼠血清瘦素含量的影响

地区处理显著影响了大绒鼠的血清瘦素含量(F1,39=2.18，P=0.012)，食物处理极显著影响了大绒鼠的血清瘦素含量(F3,39=10.60，P=0.000)，两者的交互效应差异不显著(F3,39=0.77，P=0.669，图4)。地区和食物处理显著影响了大绒鼠的NPY表达量(地区：F1,39=52.45，P=0.000；食物：F3,39=4.90，P=0.000)，两者的交互效应差异显著(F3,39=3.99，P=0.029，图5-A)。地区处理极显著影响了大绒鼠的AgRP、POMC和CART表达量(AgRP：F1,39=34.07，P=0.000，图5-B；POMC：F1,39=7.89，P=0.001，图5-C；CART：F1,39=32.19，P=0.000，图5-D)，食物处理极显著影响了大绒鼠的AgRP、POMC和CART表达量(AgRP：F3,39=6.22，P=0.000；POMC：F3,39=8.80，P=0.000；CART：F3,39=13.63，P=0.000)，但是两者的交互效应对AgRP、POMC和CART表达量影响不显著(AgRP：F3,39=1.71，P=0.180；POMC：F3,39=0.15，P=0.938；CART：F3,39=1.35，P=0.254)。

图4 短期禁食和重喂食对两地区大绒鼠血清瘦素含量的影响

3 讨论与结论

动物在适应不同食物质量或可用性时，其体重会发生显著变化[3]。已有研究表明，动物体重的变化受限食程度的影响[13]。在本研究中，短期禁食使得两地区大绒鼠体重显著下降，重喂食后恢复到对照组水平，这与其他啮齿动物相似[29]。相反，草原田鼠[30]、红背鼠和棕背鼠在禁食和重喂食条件下体重变化不大[31]。此外，两地区大绒鼠在重喂食后食物摄入量没有增加，类似于沙鼠[32]，实验室小鼠和大鼠[33]、布氏田鼠[34]以及与其同域分布的高山姬鼠[35]。相反，叙利亚仓鼠[36]和黑线毛足鼠[37]在食物被剥夺后，食物摄入量补偿性增加。因此，不同的哺乳动物对限食和重喂食的反应并不完全一致，说明各物种间存在种属差异。低浓度瘦素可以刺激NPY/AgRP通路，抑制POMC/CART通路[38]。在本研究中，发现两个地区大绒鼠禁食后血清瘦素水平显著下降，除剑川地区大绒鼠NPY和AgRP表达量变化不显著以外，限食可以显著影响其下丘脑神经肽表达量，重喂食后又可以回复到对照组水平，具有一定的表型可塑性。剑川地区较香格里拉地区环境气候温和，食物资源丰富，所以在短时间内禁食，只通过降低血清瘦素来调节体重和能量支出，故NPY和AgRP表达量变化不显著。

图5 短期禁食和重喂食对两地区大绒鼠下丘脑神经肽NPY(A)、AgRP(B)、POMC(C)和CART(D)表达量的影响

动物一般会通过改变活动行为以适应环境的变化，如限食MF1小鼠活动行为显著减少，而黑线仓鼠在限食期间活动行为显著增加[39]。本研究中，禁食导致两组大绒鼠的活动行为显著降低，这一结果与瑞士小鼠[40]和金花鼠[41]的研究相似。这可能说明当食物短缺时，大绒鼠通过减少活动相关的能量消耗，以补偿能量不足。而两地区大绒鼠禁食期间活动行为的差异可能和两地区的食物资源差异有关，香格里拉地区食物资源较差，所以一旦禁食，迅速降低活动行为，剑川地区由于食物条件较好，所以在禁食后并没有降低活动行为，反而是增加活动行为去寻找食物，还可能因为在野外觅食时食物不足，以增加活动范围来获取更多食物。

综上所述，禁食使两地区大绒鼠的体重、活动行为、血清瘦素水平和下丘脑POMC/CART表达量均显著下降。重喂食7 d后，除血清瘦素外，各生理指标恢复到对照水平。这些变化表明在不可预测的环境中，大绒鼠的能量代谢和行为模式表现出显著的可塑性，最终来适应食物资源短缺环境。通过两地区差异比较研究表明禁食对于香格里拉地区的大绒鼠影响更为明显，故同一物种在不同生境下对其能量收支和行为模式有特定的反应，存在种内差异。