蓝萼甲素通过PI3K/Akt信号通路诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡

吴沁航，鲍 刚，朱丽文，潘 扬

(南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)

乳腺癌是源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，在中年女性中具有较高的发病率和死亡率，是世界范围内危害女性身心健康最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前常用的治疗方法主要包括外科手术、放化疗和分子靶向治疗等[2-3]。尽管早期诊断、早期治疗使乳腺癌的治疗效果明显提高，然而乳腺癌术后复发和转移是乳腺癌患者的主要死因，尤其是针对三阴性乳腺癌的治疗尚缺乏有效的手段[4-5]。筛选中药抗肿瘤的活性成分已成为开发肿瘤治疗药物的有效途径之一。蓝萼甲素( glaucocalyxin A，GLA) 是蓝萼香茶菜Raddosiaamethytoieds(Benth) Ham的主要活性成分，为15-氧-16 贝壳杉烯骨架结构的二萜类化合物，具有抗肿瘤、耐缺氧等多种药理活性，但其作用靶点和机制尚不明确[6-7]。本实验旨在研究GLA对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的诱导凋亡活性及其可能的作用机制，为进一步开发天然产物有效成分治疗三阴性乳腺癌提供理论依据。

1 材料

1.1 药物及试剂蓝萼甲素(纯度98.58%，批号：DST180702-075)购自成都德思特生物技术有限公司；人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s、人正常乳腺上皮细胞株MCF-10a均购自美国ATCC公司(批号：ATCC®HTB-26、ATCC®HTB-129、ATCC®CRL-10317)；DMEM高糖培养基、0.25%胰酶、青霉素-链霉素溶液购自美国HyClone公司(批号：AAF202144、1665845、SV30010)；胎牛血清购自美国Gibco公司(批号：8108787)；二甲基亚砜(DMSO)、MTT购自美国Sigma公司(批号：SHBH2446V、SP1080)；细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司(批号：7235944)；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自上海生工有限公司(批号：8511311、B300537)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗体购自美国CST公司(批号：5174、4257、4288、9611、4691)；Bcl-2、Bcl-xl、Bax抗体购自英国Abcam公司(批号：Ab59348、Ab45002、Ab32503)；BCA蛋白定量试剂盒、ECL检测试剂盒购自上海生工有限公司(批号：C525DA 0003、D412DA0006)。

1.2 仪器DMI3000B倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；Cellometer Auto T4 细胞计数仪(美国Nexcelom公司)；SPARK 10M多功能酶标仪(瑞士TECAN公司)；HEPAcell 150i型CO2培养箱(美国Thermo公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；PowerPacTMHC电泳仪及转膜仪(美国 Bio-Rad 公司)；NIM2045凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；Light Cycler96荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；VS-1300L-V超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

2 方法

2.1 细胞培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s，乳腺正常上皮细胞株MCF-10a培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM 高糖培养基，置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养。

2.2 MTT法测定细胞的增殖活性取对数生长期的MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MCF-10a细胞，PBS漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，培养基重悬，细胞计数后以1×104个每孔接种于96孔板，细胞贴壁后分别加入100 μL浓度为0、1、2、4、8、12、20 μmol·L-1的GLA作用细胞48 h，每个浓度设5个复孔，每孔加入MTT 20 μL(5 g·L-1)，37 ℃孵育4 h后弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡15min使甲瓒充分溶解，酶标仪570 nm处测定其光吸收值(A)，计算细胞存活率/%=(A给药组/A对照组)×100%，并计算半数抑制浓度(half inhibitory concentration, IC50)。

2.3 细胞形态观察取对数生长期的MDA-MB-231细胞，PBS漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，培养基重悬，细胞计数以5×104个每孔接种于6孔板，细胞贴壁后分别加入终浓度为0、2、4、8 μmol·L-1的蓝萼甲素，37 ℃继续培养48 h，倒置显微镜观察细胞形态的变化，拍照保存。

2.4 Annexin V/PI双标记法检测MDA-MB-231细胞凋亡取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以5×106个每孔接种于6孔板，贴壁后加入0、2、4、8 μmol·L-1的蓝萼甲素培养液，培养细胞48 h，1 000 r·min-1离心5 min，收集细胞，Binding buffer重悬细胞并调整细胞浓度为1×109个·L-1，取细胞悬液100 μL，加入FITC标记的Annexin V和PI各5 μL，冰上避光反应15 min，流式细胞仪检测。

2.5 qRT-PCR检测MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bcl-xl、Bax mRNA表达取对数生长期的MDA-MB-231细胞，5×106个每孔接种于培养皿，细胞贴壁后加入0、2、4、8 μmol·L-1的蓝萼甲素作用细胞48 h，提取细胞总RNA后逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，β-actin为内参，实时荧光定量PCR对各基因进行扩增，引物序列：Bcl-2上游引物5′-GCG GCCTCTGTTTGATTTCT-3′，下游引物5′-TCACTTGT GGCCCAGATAGG-3′；Bcl-xl上游引物5′-CGTGG AAAGCGTAGACAAGG-3′，下游引物5′-GCTGCATT GTTCCCGTAGAG-3′；Bax上游引物5′-ACCATCTTT GTGGCTGGAGT-3′，下游引物5′-AAGACACAGTCC AAGGCAGT-3′；β-actin上游引物5′-ACTCTTCCA GCCTTCCTTCC-3′，下游引物5′-CAATGCCAGGGTA CATGGTG-3′，各基因相对表达量用2-ΔΔCt表示。

2.6 Westernblot检测蛋白表达变化MDA-MB-231细胞制成单细胞悬液，细胞计数后以5×106个每孔接种于培养皿，不同浓度(0、2、4、8 μmol·L-1)蓝萼甲素分别作用细胞48 h，1 000 r·min-1离心5 min，收集细胞，PBS漂洗3次，细胞蛋白提取试剂盒提取细胞全蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，调整蛋白质样品浓度，每孔上样蛋白80 μg经SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别孵育Bcl-2、Bcl-xl、Bax、p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt抗体结合膜上蛋白，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜15 min×3次，加入二抗室温孵育1 h，PBST洗膜15 min×3次，ECL发光试剂盒曝光显影。

2.7 统计学方法实验数据通过SPSS 16.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 蓝萼甲素对乳腺癌细胞的增殖抑制作用不同浓度的GLA分别作用于细胞MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MCF-10a，培养48 h后，3种细胞均受到不同程度的增殖抑制作用。见Tab 1，GLA对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制活性强于MDA-MB-435s细胞，对正常乳腺上皮细胞MCF-10a的增殖抑制活性较低，GLA对MDA-MB-231、MDA-MB-435s细胞48 h的IC50分别为5.11、6.32 μmol·L-1。

Tab 1 Effects of GLA on MDA-MB-231,MDA-MB-435s and MCF-10a cell

3.2 蓝萼甲素对MDA-MB-231细胞生长形态的影响不同浓度的GLA作用于MDA-MB-231细胞48 h后，倒置显微镜观察显示，对照组细胞呈长梭状贴壁生长，细胞间连接紧密，未见变形细胞，随着GLA浓度增大，MDA-MB-231细胞贴壁密度逐渐减小，细胞间隙增大，并且细胞形态变圆，细胞皱缩并脱落，见Fig 1。

Fig 1 Effects of GLA on MDA-MB-231 cell morphology(×200)

3.3 蓝萼甲素对MDA-MB-231细胞凋亡的影响流式细胞仪检测GLA诱导MDA-MB-231细胞凋亡。结果显示，对照组细胞总凋亡率为2.46%，随着GLA浓度增加，MDA-MB-231细胞凋亡率明显升高，2、4、8 μmol·L-1的GLA作用后，细胞总凋亡率分别为15.65%、35.56%、61.65%，与对照组相比差异有显著性，见Fig 2。

Fig 2 Effects of GLA on MDA-MB-231 cell A:GLA induced apoptosis in MDA-MB-231 cells by flow cytometry; B: Histogram of apoptotic cell rates.*P<0.05 vs control

3.4 蓝萼甲素对MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bcl-xl、Bax mRNA表达的影响qRT-PCR实验结果显示，不同浓度GLA作用MDA-MB-231细胞48 h后，与对照组相比，随着GLA浓度增加，Bcl-2和Bcl-xl mRNA的相对表达量明显下降，Bax mRNA的相对表达量明显升高，见Fig 3。

Fig 3 Effects of GLA on relative mRNA expression of Bcl-2, Bcl-xl and *P<0.05 vs control

3.5 蓝萼甲素对MDA-MB-231细胞PI3K/Akt信号通路的影响Western blot结果显示，MDA-MB-231细胞经不同浓度的蓝萼甲素给药48 h后，随着GLA浓度的增加，MDA-MB-231细胞中p-PI3K、p-Akt相对PI3K、Akt蛋白表达水平明显降低，Bcl-2及Bcl-xl蛋白相对表达量降低，Bax蛋白相对表达量升高，呈现GLA浓度依赖性，见Fig 4。

Fig 4 Effects of GLA on protein expression related to PI3K/Akt signaling *P<0.05 vs control

4 讨论

近年来对蓝萼甲素的抗肿瘤研究发现，蓝萼甲素对肝癌、肺癌、白血病、宫颈癌等均具有较强的抑制活性，其主要通过干扰细胞周期，调节机体的免疫反应抑制肿瘤的形成[8-9]。本实验研究结果显示，GLA可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-435s的增殖，并且随着药物浓度的增加，细胞间隙增大，形态发生改变。为进一步研究GLA对三阴性乳腺癌的抑制作用，本实验通过Annexin V/PI双染色法测定GLA对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，结果显示，GLA在0～8 μmol·L-1浓度范围内呈剂量依赖性诱导MDA-MB-231细胞凋亡。

PI3K/Akt通路是具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞内信号通路，参与调节细胞增殖、凋亡、存活、生长等多种细胞生理功能，而这些过程又与肿瘤的发生发展具有密切的联系，因而对其信号通路传导激活的调控是肿瘤药理学研究的热点之一[10]。PI3K在细胞因子等胞外信号刺激下，通过特异性催化磷脂酰肌醇第3位的羟基磷酸化，使细胞膜上的第二信使PIP3被激活，并迅速结合上其关键下游靶标Akt，进而磷酸化Akt第308位的苏氨酸和第473位的丝氨酸，形成有激酶活性的磷酸化Akt(p-Akt)，活化的Akt通过调控其下游基因，如mTOR、Bcl-2、caspase 9等参与肿瘤的形成和发展。Bcl-2家族蛋白作为PI3K/Akt的下游分子，在细胞凋亡调控中发挥着十分重要的作用，其主要通过内源性途径调节细胞凋亡[11]。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl等，主要定位于细胞线粒体外膜，维持线粒体膜的稳定性[12]。PI3K/Akt信号通过Bcl-2蛋白，引起促凋亡蛋白Bax从细胞质向线粒体外膜移位进而发生寡聚化，使线粒体外膜上形成离子通道，破坏线粒体膜的完整性，降低线粒体膜电位，从而诱导细胞凋亡[13-14]。Western blot及qRT-PCR实验结果显示，GLA可剂量依赖性下调MDA-MD-231细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白质的表达，降低PI3K和Akt的磷酸化水平，通过抑制PI3K/Akt信号通路在mRNA及翻译后水平同时下调MDA-MB-231细胞中Bcl-2及Bcl-xl的表达，上调Bax的表达，表明GLA可通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡。

综上所述，GLA可明显抑制乳腺癌细胞的增殖，通过抑制PI3K及Akt的磷酸化，使其下游靶标失活，并由内源性途径诱导MDA-MB-231细胞凋亡，是一种潜在的抗三阴性乳腺癌天然产物。