黄酮类化合物抗酒精性肝损伤作用及机制研究进展

欧阳香，程虹毓，胡伟琼，单佳铃，王 陆，朱继孝

( 江西中医药大学 1.中药资源与民族药研究中心，2.人文学院，江西 南昌 330004)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)对人体的身心健康影响极为严重，早期常表现为脂肪肝(alcoholic fatty liver, AFL)，AFL可进一步加重为酒精性肝炎(alcohol hepatitis, AH)、酒精性肝纤维化(alcoholichepatic fibrosis, AHF)和酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis, AC)，严重酗酒者可诱发广泛的肝细胞坏死甚至肝功能衰竭[1]。随着人民生活水平日益提高，我国饮酒人群也在不断扩大，20世纪80年代初到90年代初，北方的嗜酒人群在一般人群中的比例从0.21%升至14.30%，增长了近70倍。21世纪初，在南方及中西部省份流行病学调查结果中显示，中国饮酒人群占一般人群的比例增至30.9%～43.4%。针对酒精性肝病的治疗存在多种方式，包括戒酒、营养支持、药物治疗、联合治疗、手术治疗以及中医治疗等。药物治疗有西药(如美他多辛)和中药(包括复方、单味药和中药某些单体成分)，尽管对酒精性肝病都能起到一定的治疗效果，但是目前为止针对酒精性肝病的治疗并没有明显的特效药[2]。

黄酮类化合物(flavonoids)，别名黄碱素，黄酮体，是一类重要的植物次生代谢产物，在天然植物的根茎叶及花果中普遍存在。在结构上被定义为是以黄酮 (2-苯基色原酮) 为基本母核而衍生的一类黄色色素，主要分为二氢黄酮、黄酮、黄烷醇、二氢黄酮醇、黄酮醇、异黄酮、花青素、查耳酮以及其他酮类[3]。黄酮类化合物是一种毒副作用极小的天然抗氧化剂，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种药理活性，在临床应用方面有很大的价值。近几年国内外的研究发现黄酮类化合物具有抗酒精性肝损的作用，本文通过整理国内外文献对酒精性肝损伤发病机制、参与酒精性肝损伤的多种发病因素和黄酮类化合物的抗酒精性肝损伤作用机制进行综述，为抗酒精性肝损伤的药物筛选提供一定的理论依据。

1 酒精性肝损伤的发病机制

长期大量饮酒易引发肝脏疾病，主要在于乙醇在机体内进行氧化代谢产生一系列诱导肝损伤的级联反应。一方面，乙醇经乙醇脱氢酶氧化系统(alcohol dehydrogenase, ADH)和乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)氧化代谢过程中会产生大量的活性氧自由基。另一方面，乙醇的氧化代谢反应通过微粒体氧化代谢系统(microsomal ethanol oxidase system, MEOS)和过氧化物酶体中过氧化氢酶系统，产生包括超氧化阴离子在内的活性氧自由基，导致活性氧自由基积累形成肝损伤。活性氧在诱导肝损伤过程中起着关键性作用，因为其可对膜脂质产生攻击，进而导致脂质过氧化反应，造成肝损伤；此外，乙醇的氧化代谢使得细胞内还原型辅酶Ⅰ与氧化型辅酶Ⅰ的比例升高，这使得脂肪酸的氧化受到抑制和脂肪酸合成增加，肝脏脂肪酸积累诱导肝脏脂肪变性。另外，乙醇氧化代谢使肠道通透性增加，导致血浆内毒素水平升高，从而激活肝脏巨噬细胞产生活性氧自由基、促炎细胞因子、黏附分子等，这些细胞因子可通过激活多种信号通路诱导酒精性肝损伤。综上所述，酒精性肝损伤发病机制氧化应激、脂肪酸积累、肝脏巨噬细胞的激活和多种细胞信号转导等多种因素。

1.2 内毒素和肝库普弗细胞酒精代谢导致肠道通透性增加，血浆中脂多糖水平显著升高，内毒素LPS激活肝库普弗细胞，释放细胞因子介导肝损伤，大量临床研究已经证实，内毒素介导肝脏库普弗细胞活化已成为酒精性肝损伤发病机制的一种关键因素。正常生理状态下只有少量的肠源性内毒素透过肠道粘膜屏障进入门静脉循环到肝脏，进入肝脏的少量内毒素也可被肝脏巨噬细胞清除维持着正常的生理功能[5]。而有研究结果表明，酒精的作用改变了肠道微生物稳态导致内毒素血症，主要表现在革兰氏阴性菌在肠道过度繁殖，益生菌在数量上下降；而且酒精氧化代谢产物乙醛也破坏了肠粘膜屏障功能，使肠道通透性增加，肠道细菌或其产物与组分通过上皮细胞粘膜层到达肝脏，以此诱导肝脏损伤[6]。除此之外，内毒素通过激活Kupffer细胞，产生受体CD14和介质，如巨噬细胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)或细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1 ,ICAM-1)，其结合多形核中性粒细胞介导炎症反应。并且库普弗细胞还会产生其他介质，如前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)或肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和α-羟乙基自由基引起肝细胞损伤[7]。内毒素血症在酒精性肝损伤的发病机制中可能起着关键性的作用，酒精诱导内毒素血症的一个原因是肠道失调，即肠道微生物群组成的改变。有研究结果发现结肠中的粘膜相关微生物群组成在长期大量饮酒会发生改变，并且随着乳酸杆菌、金属锌和益生菌(燕麦)的加入通过调节肠道微生物稳态均可改善酒精性肝损伤，这进一步说明肠道失调对酒精性肝损伤的重要影响。此外，肠道通透性增加也有助于酒精性肝损伤的发展，作为酒精性肝损伤的发病机制的另外一种因素。

1.3 细胞凋亡与自噬细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于半胱天冬酶-1 (caspase-1)，并伴有大量促炎症因子的释放。caspase-1介导细胞凋亡的机制在于将IL-1β和IL-18从前体形式转变为成熟体并分泌至细胞外，引起一系列炎症反应；此外，caspase-1可切割GSDMD(gasdermin D)，触发细胞焦亡。随着对酒精性肝损伤发病机制研究的深入，研究者发现细胞焦亡也是酒精性肝病发生、发展关键机制。因为酒精可通过增加硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interactingprotein，TXNIP) 在肝脏中的表达来促进caspase-1介导的细胞焦亡通路，诱导肝脏炎症反应，进而导致肝脏的病理变化[8]。

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。乙醇暴露于肝脏中，经过一系列的代谢反应导致肝脏中脂质和蛋白质代谢发生变化。自噬受到肝脏乙醇代谢的显着影响，乙醇代谢增强了肝细胞中自噬体的形成，却抑制了溶酶体的功能。过高的自噬蛋白水平可增强饮酒者肝细胞中的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的感染性，并且溶酶体功能的抑制使蛋白质降解产生负面影响，增加了脂肪积累的可能性[9]。因此，HCV和酒精修饰的自噬显然在HCV感染的消耗酒精的患者中增强病毒复制，细胞内病毒积累和脂肪变性进展中起作用。

1.4 巨噬细胞表型变化和表观遗传改变饮酒可导致肠道通透性增加，并导致细菌衍生脂多糖从肠道转移到肝脏，从而激活免疫反应，在此过程中，巨噬细胞在酒精性肝病的发病机制中起着至关重要的作用。巨噬细胞在酒精的刺激下被激活和极化为M1和M2两种不同的表型，被募集到损伤的肝脏组织中。活化的巨噬细胞不仅能在不同的条件下保持组织的完整性,而且可通过在不同的肝脏疾病中释放丰富的促炎因子和趋化因子来破坏组织。如M1巨噬细胞可以分泌丰富的促炎细胞因子，如IL-6和 TNF-α，从而促进肝脏损伤；而M2巨噬细胞可合成IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子，重塑组织损伤，加速修复过程；然而，持续的伤口愈合和未解决的肝损伤可能导致肝纤维化。并且有研究结果发现，慢性乙醇喂养可诱导两个肝间质巨噬细胞亚群的募集，在调节肝脏炎症和组织修复中发挥不同甚至相反的作用，这也证明了酒精性肝病发生发展中巨噬细胞表型的变化起着重要的作用。因此，这就为缓解酒精性肝病提供了新的治疗靶点[10]。

表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变；这种改变是除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变。表观遗传改变包括组蛋白修饰，如乙酰化和磷酸化的变化、DNA的低甲基化和miRNAs的改变。而这些修饰可以由酒精诱导的氧化应激诱导，导致转录机制的改变和基因表达异常。具体表现在肝脏在酒精的刺激下，组蛋白和DNA修饰发生变化，和包含组蛋白乙酰转移酶、组蛋白去乙酰化酶和去乙酰化酶在内的组蛋白乙酰化相关的酶，以及甲基化酶(如DNA甲基转移酶)的改变[11]。迄今为止的研究表明，酒精暴露于肝脏组织中可能是通过氧化应激，表现出调节乙酰化，磷酸化和甲基化的组蛋白，调节染色质重塑和基因表达。而染色质修饰和miRNA改变将会导致免疫细胞功能障碍和炎症细胞因子的产生。酒精介导的表观遗传机制对于设计新的基于表观遗传的疗法来改善ALD是至关重要的。

1.5 细胞信号转导途径

1.5.1自然杀伤T细胞(NKT)介导酒精性肝损伤 自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT)是重要调节因子和效应子功能的介质，其利用Fas和TNF-α诱导细胞凋亡[12]。有研究证实，过多的酒精摄入导致肝脏中自然杀伤T细胞增加，增强了肝细胞对细胞介导裂解的高度敏感性。在酒精代谢过程中，活化的自然杀伤T细胞通过涉及酒精应激的肝细胞上Fas和TNF-α的伴随信号的机制诱导严重的肝损伤。

1.5.2Ca2+信号转导 长期大量饮酒后，酒精在肝脏中的代谢产物乙醛除了对肝细胞直接产生毒性外，其还可诱导肝细胞内游离Ca2+浓度发生变化。有研究发现酒精代谢中间产物乙醛处理后的肝细胞，胞内游离Ca2+浓度随乙醛浓度增加而升高，而线粒体跨膜电位随乙醛浓度增加而降低，并且肝细胞发生严重的损伤。这也说明酒精中间代谢产物乙醛导致严重的肝细胞极性紊乱，诱导肝细胞损伤形成肝脏疾病[13]。

1.5.3IL-6/STAT3炎症信号通路 IL-6/转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)炎症信号通路在酒精性肝病中被激活促进炎症反应，导致肝脏的不同程度的病理变化。有研究发现酒精摄入后，IL-6/STAT3信号通路得以被激活，促进炎症反应。其机制在于酒精的摄入后降低miR-29b的表达，miR-29b靶向作用于STAT3，通过负调控作用上调了STAT3的表达水平，激活了IL-6/STAT3炎症信号通路，促进炎症反应从而加重酒精性肝损伤[14]。

1.5.4TLR4信号通路 Toll样受体4(toll like receptor 4, TLR4) 及其信号转导途径涉及到重要激酶白介素1受体相 关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和转录因子核因子-κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)、TNF-α等细胞因子。而乙醇可导致Kupffer细胞对LPS的反应增强，引起炎症因子的大量产生;在TLR4信号转导途径中, CD14表达增多，同时，IRAK以及MAPK家族成员ERK1/2和p38的活化程度及其相互间的作用增强，使重要的转录因子如NF-kB活化增强，最终使TNF-α等炎症因子增多，从而造成肝脏的进一步损伤[15]。

1.5.5PERK/eIF2α通路 PERK/eIF2α信号通路参与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介导肝细胞凋亡过程，正常情况下内质网膜上的转录因子PERK以无活性的状态与内质网分子伴侣GPR78结合，ERS发生时大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白质发生堆积(即非折叠蛋白反应)，GRP78则从PERK上解离而改为与非折叠蛋白结合，引起 PERK反向自身磷酸化。磷酸化的PERK催化底物elF2α发生磷酸化，磷酸化elF2 α(pelF2α)能激活一种转录因子，诱导GRP78、GRP94等内质网分子伴侣蛋白表达增加及caspase-12的活化,启动细胞凋亡程序诱导肝细胞凋亡。有研究证实,长期摄入酒精使elF2α蛋白发生明显磷酸化,同时PERK/elF2α通路的下游信号分子 GRP78/Bip、GRP94、caspase-12和caspase-3发生过度活化，导致肝细胞凋亡[16]。因此PERK/eIF2α通路在酒精性肝细胞凋亡机制中发挥着重要的作用，参与了酒精性肝病的发生发展，为后续预防治疗酒精性肝病提供一定的理论依据。

2 黄酮类化合物抗酒精性肝损伤作用机制

黄酮类化合物因其具有很强的抗氧化活性，使得黄酮类化合物药物治疗酒精性肝病越来越显现出它们的临床价值。黄酮类化合物抗酒精性肝损伤的作用机制涉及抗氧化应激、调节肝脏脂质的代谢、抑制肝脏炎症反应等方面。

在酒精诱导肝细胞损伤模型中，研究发现紫薯黄酮和黄酮类单体化合物黄芩素均可有效降低酒精等肝毒性物质对肝细胞的毒性，其机制表现在不同浓度的紫薯黄酮干预后能有效增强总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)等抗氧化酶的活性，降低氧化产物(H2O2)的含量，黄芩素通过诱导抗氧化核转录因子(nuclear factor erythroid-2 related factor 2, Nrf2)的转录激活机制起到抗氧化的作用[17]。黄酮类单体化合物三羟异黄酮也能通过抗氧化应激对酒精性肝损伤具有预防和治疗的作用，三羟异黄酮干预治疗后发现能明显升高GSH、SOD、ADH和ALDH等酶的活性，且能降低CYP2E1 酶的活性[18]。另外，以酒精诱导小鼠肝损伤模型，大量研究结果发现槲皮素在治疗酒精性肝损伤模型方面有很好的治疗效果。其机制主要与诱导I型血红素氧化酶(heme oxygenase-1，HO-1)间接抑制乙醇诱导CYP2E1的表达和活性，激活MAPK/Nrf2信号通路上调HO-1的表达；减轻溶酶体损伤、上调自噬体与溶酶体融合关键蛋白LAMP2A的表达来减轻酒精诱导的自噬抑制等方面有关[19]。并且有研究基于酒精性肝损伤模型，用木犀草素干预治疗发现也具有显著的治疗效果，其作用机制主要表现在降低自由基生成，减轻脂质过氧化，提高SOD酶活性。因此,大量研究结果发现黄酮类化合物对酒精性肝损伤有着很好的治疗作用，并且通过多种不同的作用机制发挥着作用。

2.2 抑制肝脏炎症反应肝脏炎症反应作为酒精性肝损伤一种常见的肝脏病理变化，它的发生通过两种途径诱导产生：一是由脂肪肝阶段进一步发生脂质过氧化加重为酒精性肝炎，二是通过内毒素和氧化应激介导酒精性肝炎。在肝脏炎症反应中，细胞因子起着关键性的作用，由于抗炎细胞因子和促炎细胞因子在酒精的作用下使原本二者的平衡受到破坏，偏向于促炎细胞因子的释放。致炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8等，抗炎细胞因子包括IL-10、脂连素和TGF-β等。酒精在氧化代谢过程中诱导产生的氧化应激和内毒素都可激活NF-κB，使促炎细胞因子(如：TNF-α)释放介导炎症反应。涉及到的机制是内毒素诱导的信号转导以CD14介导的TLR4激活和随后激活NF-κB结合活性和来自库普弗细胞中还原的NADPH的自由基也可激活NF-κB结合活性使炎性细胞因子TNF-α含量增加和环加氧酶-2(cyclooxygenase,COX-2)活性升高。

研究发现，在乙醇诱导大鼠肝损伤模型中，柚皮素治疗后能明显降低血清天冬氨酸和丙氨酸转氨酶的活性，铁的水平，以及铁蛋白、TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2、MIP(细胞间粘附因子)等蛋白的表达，明显改善了酒精性肝炎症状[20]。其作用机制通过对TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2、MIP-2、iNOS和CD14等与炎症相关分子和蛋白的抑制发挥其抗酒精性肝炎活性[21]。芒果苷给药治疗发现也有很好的抗炎作用效果，它能够促进肝细胞修复、调节肝细胞炎症因子TNF-α、IL-6水平和NF-kB的mRNA表达，以此起到抗炎的作用。也有研究表明儿茶素通过抑制信号通路关键组分NF-kB的激活，从而发挥其抗酒精性肝病的治疗效果。郑今花等[22]基于酒精性脂肪肝小鼠模型，二氢槲皮素干预后其作用机制与降低了组织中TG含量和NLRP3等炎症相关蛋白表达，抑制了肝脏组织脂肪积累及伴有的炎症反应有关。另外，有研究发现，类黄酮类单体化合物花青素和黄酮木脂素类化合物水飞蓟素均能有很好的抗炎效果，其作用机制分别与抑制促炎信号通路减轻酒精诱导的肝损伤和抗氧化应激，抑制TNF-α等细胞因子和炎症介质的大量产生有关。毛橘红总黄酮提取物干预治疗可有效降低炎性细胞因子TNF-α、TGF-β1和IL-6的含量，对慢性酒精性肝损伤具有一定的保护作用。崔团等[23]基于大鼠慢性酒精性肝损伤模型，对小鼠以葛根总黄酮灌胃给药处理，发现葛根总黄酮处理之后能显著降低CD68、TNF-α、TLR2及TLR4的蛋白表达水平，因为葛根总黄酮抑制了内毒素受体TLR4、TLR2进而抑制库普弗细胞活化，从而发挥抗酒精性肝损伤的作用。NF-κB介导多种信号转导诱导酒精性肝损伤，即NF-κB的激活，进一步向下游信号级联，包括TNF-α、NO和ROS。

2.3 调节肝脏脂质的代谢正常生理情况下肝脏中脂肪酸的合成与代谢处于一种稳态平衡，长期大量饮酒的情况下，乙醇代谢通过多种机制使肝脏脂肪酸大量积累形成脂肪肝。脂肪肝的特征表现为脂滴、甘油三酯和胆固醇的在肝脏中大量积累，其发病机制涉及到CYP2E1、固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins，SREBPs)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)和MAPK等多种相关因子。乙醇诱导CYP2E1表达和活性水平的增加，在底物的作用下其衍生出的ROS抑制了肝细胞的自噬作用，导致脂质积累。SREBPs作为脂质合成酶乙酰CoA羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FAS)表达的转录因子，调控着肝脏脂质和胆固醇的合成。 PPARs是核受体超家族成员，包括 PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三种亚型，其作用广泛，包括调节脂质的代谢等。其中PPARα在调节脂质代谢发挥着重要的作用，主要表现在调节脂肪酸转运和氧化以及胆固醇的代谢。因为酒精诱导肝脏脂肪酸过多积累激活了PPARα，其对肝脏脂肪酸结合蛋白，过氧化物酶体脂肪酰辅酶A氧化酶等促进脂肪酸氧化的酶的表达有一定的调控作用。另外，MAPK在调节肝脏脂质代谢中也起重要作用，主要表现在抑制脂肪酸和胆固醇合成，从而促进脂肪在肝脏中的积累。

胡成穆等[24]利用酒精性脂肪肝大鼠模型，施加豹皮樟总黄酮以探究其对AFL大鼠肝细胞脂肪变性的影响。结果显示，豹皮樟总黄酮能明显增加脂肪肝细胞存活率，显著降低ALT、AST、TG以及脂肪分化相关蛋白、PPARγ mRNA和蛋白表达量。其作用机制可能是通过改善肝细胞活性、减少肝细胞内TG生成、抑制ADRP表达及调控肝细胞PPARγ的表达,从而改善AFL大鼠肝细胞的脂肪变性。此外，王峰等[25]通过连续给药芹菜素治疗酒精性肝损伤小鼠，利用蛋白免疫印记法检测，结果显示可显著上调肝组织中的PPARα/γ和肉毒碱棕榈酰转移酶-1蛋白表达，下调SREBP-1c、FAS、二脂酰甘油酰基转移酶、CYP2E1和NF-κB的蛋白表达，从而能够减轻肝脏组织的脂肪变性，其作用机制是通过改善PPAR-α介导的脂质代谢通路，对酒精引起的肝脏损伤起着保护作用。储金秀等[18]研究发现黄酮苷类单体化合物芦丁能明显降低酒精性肝损伤模型小鼠肝重指数和AST、MDA水平，增强SOD活性，其作用机制在于抑制脂质过氧化反应而起到抗肝损伤的作用。

3 总结与展望

ALD严重影响着人类身心健康，但目前治疗酒精性肝病并没有所谓的特效药，主要由于酒精性肝病发病机制的复杂性，大量研究结果显示大多涉及到单个致病因素或者多个因素协同作用。参与酒精性肝损伤发生和发展的作用机制涉及到炎症信号通路、肝细胞凋亡通路以及氧化应激反应等在内的多种因素。而中药中黄酮类化合物成分作为一种天然产物能有效缓解酒精性肝损伤，能通过多种机制调控酒精性肝损伤的发生和发展，起到缓解酒精性肝病的效果。来源于不同中药的总黄酮或不同的黄酮类单体化合物其作用机制也各不相同，主要通过抗氧化应激、抑制肝脏炎症反应、调控肝脏脂质代谢等多种途径缓解酒精性肝损伤。

虽然目前已在体内外证实多种黄酮类化合物可以有效治疗酒精性肝损伤，但大多为实验室研究，对其毒理学研究尚未大量展开，目前也仍无有效药物上市。因此，需加强在其安全性方面的研究，同时加快临床前和临床要求，争取早日有安全有效、作用机制明确的黄酮类药物上市。