骨肽原液促UMR106细胞增殖法的建立及验证

吴彦霖，张 媛，杨泽岸，胡文言，高 华

(1.中国食品药品检定研究院化学药品检定所药理室, 北京 102629; 2.中国生化制药工业协会，北京 100068)

骨肽是从新鲜或冷冻的猪、鹿或胎牛骨提取，加工制成的具有活性的多组分生化药[1-2]，骨肽类药物主要成分含有骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)等多种多肽类骨代谢活性因子，以及多种骨修复所需的无机元素、氨基酸及微量元素等[3]。骨肽类药物临床上主要用于骨质疏松、骨质增生、骨折及类风湿性关节炎等疾病治疗，具有刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成，调节钙磷代谢，抗炎镇痛等药理作用[4-5]。骨肽原液是骨肽类药物的原料，具有组分复杂，活性成分不明确的特点，现行的骨肽类药物质量标准收载于国家标准地升部十六册，采用理化方法进行质量控制，不能有效反映其多组分、多靶点的临床疗效[6]，因此建立关联临床功效的生物活性测定方法作为其质量控制的方法更为合理。

大鼠骨肉瘤细胞UMR106在形态和性质上保留有成骨细胞的特征，在研究中被用来代替成骨细胞，是一种国际公认的成骨样细胞，也是研究骨代谢调控较好的模式细胞[7-9]。建立骨肽原液生物活性测定方法-大鼠骨肉瘤UMR106细胞增殖实验，确定骨肽原液的限值，依据正交实验确定方法的影响因素，并参照2015年版《中国药典》9101 药品质量标准分析方法验证指导原则和9105中药生物活性测定指导原则进行方法学验证[10]。

基于上述目的，建立骨肽原液生物活性测定方法研究包括：1)建立UMR106细胞增殖实验方法；2)正交试验优化实验条件，确定实验方案；3)对建立的骨肽原液促UMR106细胞增殖实验进行方法学验证；4)对13个厂家共39批次的骨肽原液进行实验，依据实验结果制定相应的限值和判断标准。

1 材料与方法

1.1 细胞株大鼠骨肉瘤细胞株UMR106，购于中国协和医科大学基础医学院细胞中心。

1.2 仪器CKX 41倒置显微镜(日本Olympus公司)；1389 A2生物安全柜(美国Thermo Fisher公司)；3141 CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司)；6R离心机(美国Beckman Coulter公司)：Z2细胞计数仪(美国Beckman Coulter公司)；SYNERGY HT酶标仪(美国Biotek公司)。

1.3 试剂及样品胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、含谷氨酰胺的DMEM高糖培养基(Glutamine+, Glu+)、不含谷氨酰胺的DMEM高糖培养基(Glutamine-, Glu-)、胰酶均购自Gibco公司，批号分别为1989478、2044404、1998036、2053591；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)购自Hyclone公司，批号AD20616267；CCK-8购自东仁化学科技(上海)有限公司，批号NN707。 骨肽原液生产厂家及批号见Tab 1。

Tab 1 Manufacturer and batch number of bone peptide

1.4 溶液配制生长培养基：用DMEM高糖培养基(Glu+)配制含10%FBS的溶液；工作培养基：用DMEM高糖培养基(Glu-)分别配制含1%、5%、10%的FBS溶液，上述溶液4 ℃保存备用。

骨肽的样品稀释液：用工作培养基配将骨肽原液稀释为0.06、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g·L-1的溶液，临用现配。

1.5 细胞传代取对数生长期UMR106细胞融合度达到90%进行传代，吸弃瓶中培养基，取10 mL PBS清洗1遍，加2 mL 0.25% Trypsin置CO2培养箱中消化30 s，加10 mL生长培养基终止消化，吹落培养瓶上贴壁细胞，将细胞悬液移至15 mL离心管中，充分混匀，1 000 r·min-1离心5 min，离心后尽量除去上清液，加入1 mL生长培养基，轻轻吹打混匀细胞沉淀。将细胞悬液按1 ∶5比例接种至T75培养瓶中，放入37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。

1.6 骨肽原液致UMR106细胞增殖方法建立将2.2消化后的细胞用PBS洗2次，每次1 000 r·min-1离心5 min，用工作培养基稀释细胞至所需浓度，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板。37 ℃，5% CO2培养24 h。弃去孔内完全培养基，每孔加入骨肽的样品稀释液，设不加细胞的孔为完全空白组，阴性对照组(等量PBS代替药物体积)。继续培养72 h后使用CCK-8法进行测定细胞增殖率，实验操作参照试剂盒说明书。

细胞增殖率/% =(供试品组A值-完全空白组A值)/(阴性对照组A值-完全空白组A值)×100%

1.6.1线性范围和最低检测限 取2.3细胞，调整细胞密度为2 000 个/孔，用1% FBS工作培养基将厂家B(batch No. 1)和C(batch No. 1)骨肽原液配制为2.1的浓度，每孔分别加入对应的组别药物100 μL，作用48 h、72 h后计算细胞增殖率[7-9]，以细胞增殖率评价骨肽原液促UMR106细胞增殖活性，确定最低检测限。

1.6.2正交实验确定影响因素 选用厂家B(batch No. 1)的骨肽原液样品进行正交实验，正交设计方案：采用L9 (33)正交表，以3因素3水平正交实验为考察条件进行实验，具体见Tab 2和Tab 3。响应值为细胞增殖百分率。 正交实验设计表如下表所示。

Tab 2 Factors and levels of orthogonal experiment

Tab 3 Arrangement of orthogonal experiment

1.7 方法学验证[10]

1.7.1重复性 参考2.3.2正交实验结果，选用厂家B(batch No. 1)的骨肽原液样品进行重复性检验，按实验方案：样品浓度为1.0 g·L-1，培养基血清含量为2.5% FBS，铺板细胞数量为5 000 个/孔。进行3次独立试验，统计结果并进行评价。

1.7.2中间精密度 选用厂家B(bath No. 1)的骨肽原液样品进行中间精密度检验，3名实验人员按实验方案：骨肽原液样品浓度为1.0 g·L-1，培养基血清含量为2.5% FBS，铺板细胞数量为5 000 个/孔。分别进行独立试验，统计结果并进行评价。

1.7.3耐用性 选用厂家B(bath No. 1)的骨肽原液样品进行中间精密度耐用性检验，分别考察实验中一些测定条件的微小变化，包括：不同细胞铺板密度：4 500、5 000、5 500 个/孔；96孔细胞培养板上药物作用于不同位置；药物作用时间：68、72、76 h。测定结果不受影响，以确保方法的可靠性。

1.8 限值及判断标准的制定取2.3细胞，将13个生产厂家共39批骨肽原液，每孔加入100 μL含1.0 g·L-1骨肽的样品稀释液，继续培养72 h后测定细胞增殖率。以样品合格率>60%作为界限，制定骨肽原液的判断标准。

2 结果

2.1 建立骨肽原液致UMR106细胞增殖方法

2.1.1线性及最低检测限 骨肽原液药物浓度在0.06～2.0 g·L-1范围内对UMR106细胞的影响见Fig 1。厂家B(batch No. 1)和C(batch No. 1)的骨肽原液对UMR106细胞有促进增殖作用，在48～72 h、0.06～1.0 g·L-1范围内对UMR106细胞增殖作用呈时间-剂量依赖性，但厂家C的骨肽原液在48 h的2.0 g·L-1浓度剂量增殖呈下降趋势，骨肽原液对UMR106细胞增殖的最低检测限为0.06 g·L-1。

Fig 1 UMR106 cell proliferation of bone peptide solution, manufacturers B and C n=2)

2.1.2正交实验结果 根据2.3.2计算正交试验结果，在促UMR106细胞增殖实验的3个因素影响程度是：骨肽原液浓度>培养基血清含量>细胞数量。结合显微镜下细胞形态的分析结果，确定骨肽生物活性测定方法-UMR106细胞增殖实验方案为：骨肽原液浓度为1.0 g·L-1，工作培养基血清含量为2.5% FBS，铺板细胞数量为5 000 个/孔。

2.2 方法验证结果

2.2.1重复性结果 1名检验人员独立对厂家B(bath No. 1)的骨肽原液样品进行3次实验，UMR106细胞增殖率均值为247%，RSD=13%，表明此方法的重复性良好，结果见Tab 4。

Tab 4 Repeatability for UMR106 cell proliferation experiment (n=4,%)

2.2.2中间精密度结果 3名实验人员对厂家B(batch No. 1)的骨肽原液样品进行1次实验，按确定方案测定UMR106细胞增殖率，增殖率均值为261%，RSD=16%，表明此方法的中间精密度良好，见Tab 5。

Tab 5 Intermediate precision for UMR106 cell proliferation experiment (n=3,%)

2.2.3耐用性结果 对厂家B(batch No. 1)的骨肽原液样品，按确定方案测定UMR106细胞增殖率，结果表明：1)不同细胞铺板密度条件下，增殖率均值为224%，RSD=2%；2)96孔细胞培养板上药物作用于不同位置条件下，增殖率均值为214%，RSD=5%；3)药物作用不同时间条件下，增殖率均值为208%，RSD=8%(Tab 6～8)。

Tab 6 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (different cell density) (%)

Tab 7 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (cell plates in different positions of 96 well) (%)

Tab 8 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (drug treated time)

2.3 限值及判定标准的确定13个生产厂家39批骨肽原液中，有8个厂家的骨肽原液促UMR106细胞增殖率≥150%，5个厂家的骨肽原液促UMR106细胞增殖率<150%(Tab 9)。

Tab 9 Proliferation of UMR106 cells by 13 manufacturers (n=6)

3 讨论

3.1 质量标准和限值建立骨肽原液致UMR106细胞增殖实验方法，并参照2015年版《中国药典》9101 药品质量标准分析方法验证指导原则和9105中药生物活性测定指导原则，进行重复性、中间精密度、耐用性等方法学验证[10]，结果表明，骨肽原液促UMR106细胞增殖法重复性、中间精密度和耐用性良好，实验中一些测定条件的微小变化不会影响细胞增殖率，此方法可靠。且该方法操作简单，实验测定结果稳定，测定指标与骨肽类制剂药物的治疗作用密切相关，可作为骨肽原液的质量评价方法。

结合3.3实验结果得出骨肽原液致UMR106细胞增殖实验的结论，以1.0 g·L-1骨肽原液药物浓度作为限值剂量，增殖率≥150%作为符合规定的判定标准，样品合格率>60%，限值剂量及判断标准制定较合理，其中E、F两个厂家促UMR106细胞增殖率接近150%，属于边缘产品。13个生产厂家骨肽原液不同批次间实验结果一致，表明实验方法适用性较好，故可作为骨肽原液生物活性测定方法，以更好的控制产品质量。

3.2 骨形成的阶段骨形成的过程主要涉及四个阶段：骨形成初期成骨细胞数量明显增加，而后进入成骨细胞分化阶段，细胞外基质成熟，骨特征性蛋白表达，促进并参与基质矿化，最终完成骨形成。 成骨细胞的数量决定骨形成的最初速度，大鼠骨肉瘤细胞UMR106在形态和性质上保留有成骨细胞的特征，在骨肽类制剂成骨研究中具有代表性[7-9]。骨肽类制剂的临床药理作用有刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成，调节钙磷代谢，增加骨钙沉淀及抗炎、镇痛等。临床上主要用于骨质疏松症、骨质增生性疾病、骨折及类风湿性关节炎等治疗。成分复杂、活性成分不明确的骨肽类制剂生物活性评价方法的建立应以其最主要的临床治疗功效作为靶点，进行方法学研究，因此笔者选择骨形成中成骨作用进行了上述研究。

Glu是细胞培养基中常用的添加物，但在UMR106 细胞增殖实验中，Glu的存在对结果存在影响。因此在使用该法对同类多组分药物进行生物活性评价研究时，笔者建议应考虑样品中的Glu含量对实验的干扰作用。