黑骨藤提取物中3种活性成分在AA模型大鼠体内的药代动力学研究

夏 涛，王昌权，李 奎，覃小丽，王爱民，黄 勇，李月婷，巩仔鹏，郑 林

(贵州医科大学 1.贵州省药物制剂重点实验室/药用植物功效与利用国家重点实验室，2.药学院，贵州 贵阳 550004; 3.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)被认为是一种以关节滑膜炎为主要特征的慢性、全身性自身免疫性疾病，常伴随着关节破坏，软骨和骨质损伤，严重影响了患者的生活质量和健康[1]。RA的病因复杂，症状多样，研究证实，其发病机制涉及抗原、免疫细胞(CD4+T 细胞)、细胞因子(TNF-α、IL-1β)等多种因素参与的一系列免疫反应[2]。佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA) 模型临床表现、免疫学及病理反应等方面类似于人的RA，是研究RA的经典动物模型[3]。因此，选择AA模型用于实验研究。

黑骨藤为萝藦科杠柳属植物黑龙骨(PeriplocaforrestiiSchltr.)的干燥根或全株，常用于风湿关节痛、跌打损伤等症的治疗，被收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 年版)中[4]。研究表明，黑骨藤能显著降低AA模型大鼠的胸腺指数，提高肾脏、肝脏、脾脏指数，能有效降低AA模型大鼠血清、组织液中 IL-1、IL-6和TNF-α含量水平[5]；能显著减缓AA大鼠关节滑膜、软骨组织的损伤，修复被破坏的组织，能在一定程度上减缓RA的发展[6]。课题组前期从黑骨藤提取物中分离鉴定了3-O-咖啡酰基奎宁酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸、5-O-咖啡酰基奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、杠柳毒苷、杠柳苷元等化合物[7]。已有研究报道，黑骨藤提取物中咖啡酰基奎宁酸类单体化合物对人RA成纤维样滑膜细胞MH7A的增殖速度具有显著的抑制作用，推测该类化合物可能通过抑制MAPK信号通路的激活，降低NF-κB活性，抑制下游炎症因子表达而产生抗RA的作用[8-9]。但迄今为止，关于黑骨藤体内过程的研究尚未见报道。且越来越多研究表明，病理状态会改变中药药代动力学特征，对药物的ADME过程产生一定影响[10]。因此，开展中药多效应成分在病理状态下的药代动力研究学，对于阐明中药的物质基础、指导临床用药安全、有效等具有重要意义。

鉴于此，在前期的工作基础上，选择黑骨藤提取物中3-O-咖啡酰基奎宁酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸和5-O-咖啡酰基奎宁酸为指标性成分，建立血浆中同时测定3种成分的HPLC-MS/MS分析方法，开展黑骨藤提取物在AA模型大鼠体内的药代动力学研究，探究黑骨藤提取物的药动学特征，为黑骨藤的药效物质基础及体内过程提供参考，为黑骨藤的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂3-O-咖啡酰基奎宁酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201415，纯度≥98%)；4-O-咖啡酰基奎宁酸，5-O-咖啡酰基奎宁酸对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为：AB7061002，AB7050442，纯度均≥98%)；葛根素(江西佰草源生物科技有限公司，批号：BCY-0245，纯度≥98%)；黑骨藤提取物(自制，批号：20171113)；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AB5500质谱(Analyst、MultiQuant工作站，美国AB公司)；Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman 公司)；AE240 十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司) ；ZH-2涡旋混合器(天津药典标准仪器厂)；CQ 250A-TS超声波清洗机(上海跃进医用光学器械厂)；MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)。

1.3 实验动物健康Sprague-Dawley大鼠，SPF级，♂，体质量(200±20) g，购自贵州医科大学实验动物中心，合格证号SCXK(黔)2018-0001，经贵州医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号1603125)。

1.4 溶液的配制

1.4.1对照品溶液的配制 精密称取3种成分对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得3-O-咖啡酰基奎宁酸(1.114 g·L-1)，5-O-咖啡酰基奎宁酸(1.024 g·L-1)，4-O-咖啡酰基奎宁酸(1.086 g·L-1)等对照品储备液。分别精密量取上述3种对照品储备液100 μL于10 mL容量瓶中定容，用甲醇逐级稀释得混合系列标准溶液，-20 ℃保存。

1.4.2内标溶液配制 精密称取葛根素适量于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得葛根素(1.011 g·L-1)储备液，-20 ℃保存，备用。取内标储备液用甲醇配制成20.20 μg·L-1的内标溶液。

1.4.3枸橼酸钠溶液配制 精密称取0.32 g枸橼酸钠粉末，溶于生理盐水中，定容至10 mL，得32 g·L-1枸橼酸钠溶液，4 ℃保存，备用。

1.4.4黑骨藤提取物制备 黑骨藤药材30 kg，加8倍量70%乙醇提取2次，提取时间分别为1.5、1.0 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至1 000 g·L-1(以生药计)，45 ℃真空干燥，即得，提取率7.68%。

1.5LC-MS/MS条件

1.5.1色谱条件 色谱柱：ACEC18-PFP(150 mm×4.6 mm, 3 μm)；流动相：0.1%甲酸乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)，梯度洗脱(0～2 min，20%～40% B；2～5 min，40%～50% B；5～5.5 min，50% B；5.5～5.6 min，50%～90% B；5.6～7 min，90% B；7～7.1 min，90%～20% B；7.1～9 min，20% B)；流速：0.6 mL·min-1，柱温：40 ℃，进样器的温度：15 ℃；进样体积为1 μL。

1.5.2质谱条件 采用电喷雾电离源(ESI-)，毛细管电离电压：-4.5 kV，离子源温度：550 ℃；喷雾气与反吹气：N2，离子源气体1 ∶55 psi，离子源气体2 ∶55 psi，扫描方式为MRM模式检测，质谱数据采集及处理软件为Analyst、MultiQuant工作站。3-O-咖啡酰基奎宁酸等3种成分及内标用于定量分析的监测离子，见Tab 1。

Tab 1 Mass spectrometric conditions of three components

1.6 AA模型大鼠的制备取雄鼠8只，测定其足容积及踝关节周长作为基础值，于每只大鼠右后足足垫皮内注射0.1 mL CFA试剂，7 d后再次免疫，造模21 d。

1.7 血浆样品的处理取各血浆样品200 μL，置1.5 mL EP管中，补加甲醇100 μL，依次加入50 μL葛根素内标溶液(20.20 μg·L-1)，10%甲酸水50 μL，涡旋混合(1 min)，加甲醇800 μL，涡旋混合(5 min)，超声(10 min，100 kHz)，离心(12 000 r·min-1，10 min)，取上清液置离心管中，37 ℃下氮气吹干。用初始流动相200 μL溶解，涡旋混合(5 min)，超声(10 min，100 kHz)，离心(13 000 r·min-1，10 min)，取上清液置于进样瓶中，照“1.5”项下的检测条件分析。

1.8 动物给药及血浆样品采集于造模21 d后，选择造模成功的SD大鼠8只，口服灌胃黑骨藤提取物87 g·kg-1(以生药计)，给药前12 h禁食，自由饮水。于末次给药后5、15、30、45 min、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h经尾静脉取约0.3 mL的全血置涂有枸橼酸钠的1.5 mL塑料离心管中，6 000 r·min-1离心6 min，上清液用塑料离心管分装，保存于-20 ℃冰箱中，备用。

2 结果

2.1 专属性考察取大鼠空白血浆200 μL，除不加葛根素内标外，其余按本部分“1.7”项下操作，获得空白血浆样品色谱图A；将一定浓度标准溶液和内标溶液加入空白血浆，依法操作，获得相应的标准品色谱图B；取大鼠给药后血浆，依法操作得相应的样品色谱图C。由Fig 1可以看出，各成分间分离良好，血浆中内源性物质不干扰待测成分的测定。

Fig 1 Typical HPLC-MS/MS chromatogramsA:Blank plasma;B:The rat plasma sample collected after i.g of Periploca forrestii Schltr extract to rats;C:Blank plasma spiked with three components 1.3-O-caffeoyl quinic acid 2.4-O-caffeoyl quinic acid 3.5-O-caffeoyl quinic acid 4. Puerarin(IS)

2.2 标准曲线和线性范围考察取大鼠空白血浆200 μL，分别加入3个用甲醇按梯度稀释的混合标准溶液100 μL，配制成相当于大鼠血浆药物浓度见Tab 2，参照“1.7”项下操作。以待测物的峰面积与内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y，各物质浓度(C)为横坐标X进行直线回归，权重系数为1/X，求得直线方程，即为标准曲线，结果见Tab 3。定量限(LOQ)定义为S/N≥10，检测限(LOD)义为S/N≥3[11]。

Tab 2 Concentrations of three standard protocatechuate samples(μg·L-1)

Tab 3 Linar ranges and regression equations of 3-O-caffeoyl quinic acid,4-O-caffeoyl quinic acid,5-O-caffeoyl quinic acid

2.3 准确度和精密度考察按“2.2”项下分别配制3种成分大鼠血浆低、中、高(3-O-咖啡酰基奎宁酸为17.41、139.25、1 114.00 μg·L-1，4-O-咖啡酰基奎宁酸为16.97、135.75、1 086.00 μg·L-1，5-O-咖啡酰基奎宁酸为16、128、1 024 μg·L-1)3个浓度的血浆样品，按“1.7”项下操作，每个浓度平行5份，日内连续进样，并与标准曲线同时进行。每个系列浓度做5份，计算日内精密度；3种浓度连续测定3 d，计算日间精密度。结果表明3种成分的日内和日间精密度RSD(%)均小于13%，准确度范围为85.25%～99.30%，提示该方法准确、可靠、重现性好，符合生物样品分析方法要求。

2.4 提取回收率和基质效应考察取大鼠空白血浆200 μL，按“2.2”项下分别配制低、中、高3个浓度的血浆样品(浓度同2.3项下)，每个浓度平行5份，按“1.7”项下方法处理进样分析，记录峰面积为A；另取空白血浆200 μL，除不加混合标准溶液外，其余按“1.7”项下方法操作，向上清液中加入相应低、中、高浓度的混合标准溶液和内标，吹干，残留物以200 μL初始流动相溶解，进样分析记录峰面积为B；另取上述低、中、高浓度的混合标准溶液与内标，吹干，残留物以200 μL初始流动相溶解，进样分析记录峰面积为C。计算提取回收率/%=A/B×100%，基质效应/%=B/C×100%。结果表明3-O-咖啡酰基奎宁酸等3种成分的提取回收率分别为：84.30%～109.45%、98.52%～111.94%、99.51%～111.55%，基质效应分别为：81.96%～101.35%、84.01%～86.84%、81.19%～87.52%，结果表明提取回收率符合生物样品分析方法要求。

2.5 样品稳定性实验按“2.2”项下分别配制3种成分的血浆低、中、高3个浓度(浓度同3.3项下)QC样品，考察样品处理后分别至室温(约25 ℃)中，4 ℃下冷藏24 h，反复冻融(-20 ℃)3次，并在3种环境下的稳定性，结果见Tab 4。结果表明血浆样本上述处理条件下均稳定，满足生物样品分析方法要求。

Tab 4 Stability(24 h at room temperature, 24 h storedat 4 ℃, Freeze-thaw cycles) of three components in rat

2.6 黑骨藤提取物在AA模型大鼠体内药动学比较研究AA模型大鼠口服黑骨藤提取物后，应用建立的HPLC-MS/MS分析方法测定大鼠体内3-O-咖啡酰基奎宁酸等3种成分的血药浓度，平均血药浓度-时间曲线见Fig 2。采用 WinNonlin 6.4软件对药物在大鼠体内的动力学过程进行非房室模型拟合并计算其相关药动学参数见Tab 5。

Tab 5 Pharmacokinetic parameters of three components after i.g of Periploca forrestii Schltr.

Fig 2 Concentration-time profiles of three components after i.g of Periploca forrestii Schltr.

3 讨论

建立HPLC-MS/MS分析方法，采用ESI-1源、多反应监测模式(MRM)，同时测定AA模型大鼠血浆中3-O-咖啡酰基奎宁酸等3种成分的浓度，该分析方法具有测定时间较短、专属性好、内源性干扰小等特点[12]，并将该分析方法成功地应用于黑骨藤提取物的药代动力学研究。预实验中考察了生物样品处理方法，最终确定先用10%的甲酸酸化血浆，再加入甲醇沉淀蛋白进行血浆样品的处理，该方法得到的峰较尖锐、基线较平稳，且回收率和基质效应满足生物样品的分析要求。

非房室模型假设药物末端以单指数消除，不受房室模型的限制，适用于大多数药物[13]。因此试验采用药动学软件WinNonlin 6. 4的非房室模型处理数据，用时间-血浆浓度曲线下面积(AUC)、平均滞留时间(MRT)、达峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、半衰期(t1/2)、表观分布容积(V)、清除率(CL)等参数描述黑骨藤提取物中3-O-咖啡酰基奎宁酸等3个指标性成分在AA模型大鼠体内的药动学过程。Cmax、Tmax是衡量药物吸收程度和速率的主要参数，研究结果显示，口服黑骨藤提取物后，3-O-咖啡酰基奎宁酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸和5-O-咖啡酰基奎宁酸的Tmax均为1 h左右，3-O-咖啡酰基奎宁酸的Cmax较大；AUC是评价药物吸收程度的一项重要指标，3-O-咖啡酰基奎宁酸的AUC较大；t1/2和MRT是衡量药物在体内消除快慢和速率的参数，3-O-咖啡酰基奎宁酸的t1/2为5.99 h，MRT为6.93 h，4-O-咖啡酰基奎宁酸的t1/2为7.35 h，MRT为6.93 h；5-O-咖啡酰基奎宁酸的t1/2为6.83 h，MRT为7.42 h。结果表明黑骨藤提取物在AA模型大鼠体内吸收快，消除迅速，不容易在体内蓄积。

本实验建立了HPLC-MS/MS法测定黑骨藤提取物中3 个单咖啡酰基奎宁酸类成分的血药浓度，并成功应用于其药动学研究，阐明 3 个单咖啡酰基奎宁酸类成分的药动特征，为黑骨藤药材的药效物质基础研究及创新药物研制、临床合理应用提供了一定理论基础和参考。