LncRNA LINC01138靶向miR-193a-3p对卵巢癌A2780细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

晁宏图，张孟丽

河南省肿瘤医院(郑州大学附属肿瘤医院)妇瘤科 郑州 450003

卵巢癌在女性生殖系统相关疾病中占较高比例，严重影响女性生命安全，但目前关于卵巢癌的发病机制尚未完全阐明[1]。探究卵巢癌发病机制对降低卵巢癌发病率及病死率具有重要意义。长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA，LncRNA)是一种内源性非编码RNA分子，研究[2]表明部分LncRNA在卵巢癌中异常表达并参与了卵巢癌发生发展过程。研究[3]表明LncRNA LINC01138在卵巢癌细胞中表达上调，但LINC01138对卵巢癌细胞生物学行为的影响尚未可知。LINC01138在肝癌、肾癌、胃癌等恶性肿瘤中呈高表达，并可促进癌细胞增殖、转移[4-6]。研究[7]表明miR-193a-3p在卵巢癌细胞中呈低表达，并可抑制细胞增殖及转移。starBase预测显示微小RNA-193a-3p(miR-193a-3p)可能为LINC01138的靶基因。本研究分析了LINC01138与miR-193a-3p在卵巢癌细胞中的表达水平，探讨LINC01138与miR-193a-3p之间的相互作用，及两者在卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡过程中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1标本、细胞与试剂收集2017年2月至2019年1月河南省肿瘤医院收治的卵巢癌患者40例，均经病理学证实为卵巢癌，年龄50～70(60.1±8.2)岁。所有患者均接受手术治疗，术中切除卵巢癌组织及癌旁正常卵巢组织，于液氮中保存，术后转移至-80 ℃超低温冰箱保存。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。正常卵巢上皮细胞HOSE与卵巢癌细胞A2780、SKOV3、OVCR3均购自美国ATCC细胞库。DMEM培养基、胰蛋白酶均购自上海百研生物科技有限公司；Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；LINC01138小干扰RNA(si-LINC01138)及其无义阴性序列(si-con)、miR-193a-3p 模拟物(mimics)及其阴性对照(miR-con)、miR-193a-3p特异性寡核苷酸抑制剂 (anti-miR-193a-3p)及其阴性对照(anti-miR-con)均购自上海吉玛制药技术有限公司；Trizol、反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自日本TaKaRa公司； MTT购自杭州联科生物技术股份有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell小室与Matrigel基质胶均购自美国Corning公司；蛋白裂解液购自苏州新赛美生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2细胞转染及分组正常卵巢上皮细胞(HOSE)及3种卵巢癌细胞(A2780、SKOV3、OVCR3)均培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，稳定传代培养3代。收集对数生长期卵巢癌A2780细胞，参照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染，实验分组：正常对照组(不转染)、si-con组(转染si-con)、si-LINC01138组(转染si-LINC01138)、si-LINC01138+anti-miR-con组(共转染si-LINC01138与anti-miR-con)、si-LINC01138+anti-miR-193a-3p组(共转染si-LINC01138与anti-miR-193a-3p)，转染6 h后更换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h，收集对数生长期细胞进行后续实验。每组3个复孔，实验重复3次。

1.3卵巢癌组织及细胞中LINC01138、miR-193a-3p表达的qRT-PCR法检测取卵巢癌、癌旁正常卵巢组织及各组细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，参照反转录试剂盒合成cDNA。LINC01138正向引物5’-TATTTACGAAAGCTGAAAGCG-3’，反向引物5’-CTGCATGGGATAGGAGAAAC-3’(262 bp)；GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACT TCTCATGG-3’(494 bp)；miR-193a-3p正向引物5’-AACTGGCCTACAAAGTCCCAGT-3’，反向引物5’-ACTGGGACTTTGTAGGCCAGTT-3’(391 bp)；U6正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’(128 bp)；引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA为模板进行PCR反应，反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。LINC01138以GAPDH为内参。miR-193a-3p以U6为内参。采用2-ΔΔCt法计算LINC01138、miR-193a-3p相对表达量。

1.4细胞活力的MTT法检测收集对数生长期细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入用含血清的DMEM培养基制备的单细胞悬液，细胞密度3×104个/mL，接种于96孔板，每孔加入20 μL MTT溶液，室温孵育4 h，弃上清，每孔分别加入150 μL二甲基亚砜，低速振荡10 min，采用酶标仪于490 nm处检测各孔吸光度(A)值，以A值表示细胞活力。

1.5细胞凋亡率的检测取对数生长期细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集细胞，预冷PBS清洗，加入500 μL结合缓冲液，依次加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI，室温避光孵育10 min，于1 h内应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6细胞迁移及侵袭能力的检测细胞迁移实验：取对数生长期细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化。用DMEM培养液制备单细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于Transwell小室的上室(200 μL/孔)，取含体积分数10%胎牛血清培养基600 μL加入下室，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养24 h。PBS洗涤，加入多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤，结晶紫染液染色10 min，擦拭未迁移细胞。显微镜下选取5个200倍视野统计迁移细胞数。细胞侵袭实验：用预冷培养液按照体积比8∶1稀释Matrigel基质胶，Transwell小室上室加入Matrigel稀释液(40 μL/孔)，于37 ℃恒温培养箱培养5 h；后续实验步骤同细胞迁移实验。

1.7双荧光素酶报告实验利用LncBase网站对 LINC01138和miR-193a-3p的结合位点进行预测，利用基因突变技术将结合位点进行突变，分别构建含有结合位点、突变位点的野生型荧光素酶报告基因载体(LINC01138-WT)与突变型载体(LINC01138-MUT)。同时取对数生长期A2780细胞，参照Lipofectamine2000转染试剂说明书分别将miR-193a-3p mimics、miR-con与LINC01138-WT、LINC01138-MUT共转染。转染后继续培养24 h，按照荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.8统计学处理采用SPSS 21.0分析数据。卵巢癌与癌旁正常卵巢组织中LINC01138和miR-193a-3p相对表达量的比较采用配对资料的t检验；HOSE及A2780、SKOV3、OVCR3细胞中LINC01138和miR-193a-3p相对表达量的比较，si-LINC01138组、si-LINC01138+anti-miR-con组、si-LINC01138+anti-miR-193a-3p组miR-193a-3p相对表达量、A值、细胞迁移数、细胞侵袭数和凋亡率的比较均采用单因素方差分析及LSD-t检验；正常对照组、si-con组、si-LINC01138组LINC01138和miR-193a-3p相对表达量、A值、细胞迁移数、细胞侵袭数和凋亡率的比较均采用单因素方差分析及LSD-t检验；miR-con组、miR-193a-3p组荧光素酶活性的比较均采用两独立样本的t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1卵巢癌组织和细胞中LINC01138及miR-193a-3p的表达与癌旁正常卵巢组织相比，卵巢癌组织中LINC01138表达升高，miR-193a-3p表达降低。与正常卵巢上皮细胞HOSE比较，卵巢癌细胞A2780、SKOV3、OVCR3中LINC01138的表达升高，miR-193a-3p表达降低；其中A2780细胞中的表达变化最大，因而选用A2780细胞进行后续实验。见表1、2。

表1 卵巢癌与癌旁正常卵巢组织中LINC01138和miR-193a-3p表达的比较(n=40)

表2 HOSE及3种卵巢癌细胞中LINC01138和miR-193a-3p表达的比较(n=3)

2.2抑制LINC01138表达对A2780细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响与si-con组相比，si-LINC01138组细胞中LINC01138的表达降低，细胞活力降低，迁移及侵袭细胞数均减少，细胞凋亡率升高，见表3。

2.3LINC01138和miR-193a-3p的靶向关系LINC01138和miR-193a-3p的结合位点预测结果见图1。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-con+LINC01138-WT组荧光素酶活性降低(表4)。

2.4抑制miR-193a-3p的表达对转染si-LINC01138的A2780细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响与si-LINC01138+anti-miR-con组相比，si-LINC01138+anti-miR-193a-3p组A2780细胞中miR-193a-3p的相对表达量降低，细胞活力增强，迁移及侵袭细胞数增加，细胞凋亡率降低，见表5。

表3 正常对照组、si-con组、si-LINC01138组A2780细胞中LINC01138相对表达量、miR-193a-3p相对表达量、A值、细胞迁移数、细胞侵袭数和凋亡率的比较(n=3)

图1 LINC01138与miR-193a-3p的结合位点预测

表4 双荧光素酶报告实验结果(n=3)

表5 3组A2780细胞miR-193a-3p相对表达量、A值、细胞迁移数、细胞侵袭数和凋亡率的比较(n=3)

3 讨论

LINC01138在前列腺癌组织中呈高表达，并可作为前列腺癌临床诊断及预后评估的分子标志物[8]。但LINC01138在卵巢癌发生及转移中的具体作用机制尚未完全阐明。本研究结果显示不同卵巢癌细胞中LINC01138的表达均增加，提示LINC01138的表达水平升高可能参与卵巢癌发生过程。本研究结果还显示，卵巢癌A2780细胞中抑制LINC01138表达后细胞增殖能力降低，迁移及侵袭细胞数均减少，而凋亡率升高，说明抑制LINC01138表达可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭，并诱导细胞凋亡，提示LINC01138可能成为卵巢癌靶向治疗的潜在靶点，但关于LINC01138对下游靶基因的调控作用仍需进一步研究。

miR-193a-3p可通过靶向抑制KRAS表达而抑制肺癌发生及发展[9]。LncRNA ZFAS1可靶向miR-193a-3p促进非小细胞肺癌的恶性进展[10]。研究[11]表明miR-193a-3p通过下调PLAU表达而抑制结肠直肠癌细胞增殖。miR-193a-3p通过靶向CCND1抑制胰腺癌细胞增殖[12]。本研究通过双荧光素酶报告实验与qRT-PCR实验证明LINC01138可靶向结合miR-193a-3p，并可负向调控miR-193a-3p的表达；进一步研究结果显示抑制miR-193a-3p的表达可逆转抑制LINC01138 表达对卵巢癌A2780细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。提示抑制LINC01138表达可通过上调miR-193a-3p的表达而降低卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，并可促进细胞凋亡。

综上所述，LINC01138通过与miR-193a-3p相互作用调控卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡行为。LINC01138在卵巢癌细胞中呈高表达并可通过影响卵巢癌细胞恶性生物学行为发挥促癌基因作用，这为卵巢癌靶向治疗提供了潜在靶点。