FHIT及Apollon蛋白在结直肠癌组织中的表达特征及预后预测价值

徐纪中，袁维堂，王贵宪，周全博，胡晟云

郑州大学第一附属医院结直肠肛门外科 郑州 450052

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是临床常见消化道恶性肿瘤。据调查[1]，世界范围内CRC每年新发病例约800万，发病率和死亡率均位居恶性肿瘤前列，近年来随着人们生活节奏的加快及饮食结构的改变，其发病率呈逐年升高趋势。CRC起病隐匿，早期症状不典型，故多数患者确诊时已至局部晚期或发生远处转移，尤其以肝转移最为常见，导致根治术、放化疗效果不理想，预后较差[2]。随着分子生物学研究的进展，人们发现抑癌基因失活及凋亡抑制基因过度表达在恶性肿瘤发生、发展及转移过程中起重要作用。脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)基因是一种包含人类染色体脆性位点的抑癌基因，目前已有报道[3]其在肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤组织中异常表达。另有研究[4]表明，凋亡抑制蛋白Apollon过度表达可促进细胞的恶性变。FHIT和Apollon蛋白在肿瘤发生、发展过程中均起重要作用，但关于其对CRC转移病程影响的研究尚少。本研究对既往收治的163例CRC患者的临床资料进行回顾，分析FHIT和Apollon蛋白在CRC组织中的表达情况，重点探讨其与CRC转移及预后的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象回顾性分析2012年7月至2014年6月我院收治的163例CRC患者的临床资料。其中男84例，女79例；年龄35～71(58.7±6.2)岁；肿瘤部位：结肠138例，直肠25例；肿瘤直径≤5 cm者92例，>5 cm者71例；分化程度：高分化72例，中分化59例，低分化32例；浸润深度：肌层65例，浆膜外60例，浆膜层38例；Dukes分期：A、B期46例，C、D期117例；组织学分型：管状/乳头状腺癌118例，黏液腺癌30例，印戒细胞癌15例；有淋巴结转移117例；有同时性结直肠癌肝转移(SCRLM)93例，无SCRLM 70例。研究获得医院伦理委员会审批。

CRC患者均符合以下纳排标准。纳入标准：①接受CRC根治术治疗。②术后病理检测确诊为CRC，SCRLM经病理学检查肝转移灶来源于CRC。③术前均未进行化疗。④临床资料完整。排除标准：①合并其他部位原发性恶性肿瘤。②术后随访资料缺失。③有严重贫血、感染或凝血功能障碍。

1.2FHIT及Apollon蛋白表达的检测收集CRC癌组织、癌旁组织(距离病灶<3 cm，非正常组织)，均采用体积分数10%中性甲醛固定，修整为1 cm3组织块，经梯度乙醇脱水、二甲苯固定后，石蜡包埋，制作4 μm厚连续切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、热修复后，用体积分数3%过氧化氢孵育，PBS洗涤，封闭液封闭；每张切片加入1∶100稀释的兔抗人FHIT、Apollon多抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)37 ℃孵育1 h，加入生物素标记的二抗继续孵育30 min；DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，光学显微镜下观察染色结果。FHIT蛋白定位于细胞质，Apollon蛋白定位于细胞质和(或)细胞核。采用双评分半定量分析法[5]判定蛋白表达情况。200倍镜下每张切片随机选取5个视野：按染色强度评分，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞百分数评分，无阳性细胞为0分，≤10%为1分，≤50%且>10%为2分，≤75%且>50%为3分，>75%为4分。两项评分乘积≤1判定为阴性，≥2判定为阳性。

1.3资料的收集及分析收集CRC患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度等临床及病理资料。采用门诊或电话方式进行随访，以接受手术治疗为随访起始时间，以患者死亡、失访或研究截止时间(2019年7月)为终点事件，计算总生存时间。

1.4统计学处理采用SPSS 19.0分析处理数据。CRC及癌旁组织中FHIT、Apollon阳性率的比较采用配对χ2检验，不同临床病理特征CRC组织中FHIT、Apollon阳性率的比较采用χ2检验或精确概率法，采用列联系数c评估CRC组织中FHIT、Apollon表达的关联性；采用Kaplan-Meier法绘制不同FHIT、Apollon表达特征的CRC患者的生存曲线并进行log-rank检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1CRC组织中FHIT及Apollon蛋白的表达CRC组织中，FHIT和Apollon蛋白阳性率分别为32.5%和84.7%，癌旁组织中分别为67.5%和48.5%。与癌旁组织比较，CRC组织中FHIT蛋白阳性率降低，Apollon蛋白阳性率升高，见表1、2。CRC组织中FHIT与Apollon蛋白表达存在负关联,见表3。

表1 CRC与癌旁组织中FHIT蛋白表达的比较 例

表2 CRC与癌旁组织中Apollon蛋白表达的比较 例

表3 CRC组织中FHIT与Apollon蛋白表达的关联性分析 例

2.2不同临床病理特征CRC组织中FHIT及Apollon蛋白表达的比较与浸润至肌层或浆膜外、Dukes分期A或B期、无淋巴结转移、无SCRLM者比较，浸润至浆膜层、Dukes分期C或D期、有淋巴结转移、有SCRLM的CRC组织中FHIT阳性率降低，Apollon阳性率升高(P<0.05)；而不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、组织学分型、大便隐血试验状态、HBsAg状态及腹腔积液状态的患者FHIT、Apollon阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 不同临床病理参数CRC组织中FHIT及Apollon蛋白表达的比较 例(%)

续表4

2.3FHIT、Apollon表达与CRC预后的关系163例生存曲线见图1。FHIT+Apollon-患者预后优于FHIT+Apollon+患者(χ2=10.765，P<0.001)；FHIT-Apollon+、FHIT-Apollon-患者预后差于FHIT+Apollon+患者(χ2=9.154、12.130，P<0.001)；FHIT-Apollon+与FHIT-Apollon-患者生存曲线比较，差异无统计学意义(χ2=0.205，P=0.651)。

图1 不同FHIT、Apollon表达状态的CRC患者的生存曲线

3 讨论

CRC属于结肠黏膜上皮细胞恶性肿瘤，其发病原因与不良生活习惯、遗传及环境因素等关系密切[6]。由于肠道血供及淋巴回流丰富，CRC细胞更易通过血液及淋巴循环发生远端转移，导致多数患者确诊时已失去最佳治疗时机，预后差[7]。因此，急需寻找可早期预测CRC复发和转移的标志物，以便能及时有效干预，改善患者预后，延长生存期。

FHIT蛋白是三联组氨酸家族重要成员，生理状态下可在机体多种组织中表达。本研究发现CRC组织中FHIT蛋白阳性率低于癌旁组织，Apollon阳性率高于癌旁组织，提示FHIT蛋白表达缺失或Apollon蛋白表达增强与CRC的发生关系密切。Zheng等[8]研究发现，FHIT在胃癌中的表达水平低于正常胃黏膜组织，且其表达水平与浸润深度、淋巴结转移、远端转移及分化程度负相关。Apollon是凋亡抑制蛋白家族中相对分子质量最大的蛋白，其特有结构域杆状病毒IAP重复序列(BIR)可与Caspase-9、Smac结合并促进其降解，从而抑制Caspase-9前体活化，抑制凋亡信号启动，从而有利于癌细胞的无限增殖、转移等过程[9]。本研究中与浸润至肌层或浆膜外、Dukes分期A或B期、无淋巴结转移、无SCRLM者比较，浸润至浆膜层、Dukes分期C或D期、有淋巴结转移、有SCRLM的CRC组织中FHIT阳性率降低，Apollon阳性率升高，提示FHIT蛋白表达异常降低或Apollon蛋白表达异常升高均有利于CRC细胞的侵袭、转移。

Druck等[10]研究表明，FHIT可通过死亡受体途径和线粒体依赖凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1/Caspase-9两种信号通路诱导细胞凋亡；FHIT蛋白具有显著的抑癌作用，但其作用机制尚不明确，有研究[11-12]认为与FHIT具有二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶、mRNA脱帽、形成FHIT底物复合物等多种因素有关。而Apollon可促进Caspase-9降解，从而抑制凋亡进程；两者可能存在负调节及相互抑制的关系。本研究发现，CRC组织中FHIT与Apollon蛋白表达存在较微弱的负向关联性。

禹志韫等[13]研究发现，FHIT阳性宫颈癌患者1 a生存率明显高于FHIT阴性患者，提示FHIT与肿瘤预后关系密切。吴珏堃等[14]采用小干扰RNA法敲低乳腺癌MCF-7细胞Apollon基因，结果显示低表达Apollon基因的乳腺癌细胞对顺铂的敏感性增强，提示Apollon与肿瘤治疗转归关系密切。本研究经Kaplan-Meier生存分析发现，FHIT阴性表达(FHIT-Apollon+、FHIT-Apollon-)患者的预后均差于阳性表达(FHIT+Apollon+、FHIT+Apollon-)者;Apollon阳性表达(FHIT-Apollon+)患者预后差于阴性表达(FHIT+Apollon-)者;进一步证实FHIT蛋白低表达和Apollon蛋白高表达不利于CRC的预后转归。

综上所述，FHIT和Apollon蛋白在CRC组织中的表达呈负相关，两者的表达与CRC侵袭、转移及预后关系密切，可作为预测CRC转移及预后的可靠标志物；临床上可通过靶向调控FHIT与Apollon的表达，调控CRC细胞增殖、转移等过程。本研究的不足之处在于，纳入研究对象较少，随访时间较短。我们进一步将扩大样本量，开展多中心、高质量随机对照研究，以证实本研究结果的稳定性和正确性，为CRC临床治疗提供一定理论依据。