河南地区新记录蝇种郭氏欧麻蝇形态和DNA条形码鉴定

高 洁，张 芳 ，张 勤，曹晓婉，王富昌，张卫东

1)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001 2)郑州海关技术中心 郑州 450003 3)河南捷信检测认证有限公司 郑州 450003

蝇类隶属于昆虫纲双翅目，分布极其广泛。已证实[1]，蝇类能传播的细菌有100多种，病毒20种，原虫30多种，可携带螨类等体外寄生虫；另外，孳生习性不同的蝇种携带的病原体种类也不同。因此，为了更好地掌握和控制蝇类传播疾病，加强防控物种入侵对口岸造成的危害[2]，准确鉴定蝇种具有重要意义。目前昆虫鉴定的经典方法是形态特征鉴定，并辅之以比较解剖学特征、地理分布等信息。但形态学分类方法有一定的局限性，比如容易受到形态完整性的影响及虫态的限制，隐存种的鉴定困难,过于依靠雄性成虫的尾器形态而雌性蝇类无法准确鉴定等[3]，另外在近缘及稀有种的鉴定上对于专业知识的要求更为苛刻。因此，急需一种精确、快速、操作简便以及检测范围广的分类鉴定工具。DNA条形码技术是一种应用线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)的基因片段对物种进行快速、准确鉴定的生物身份识别技术[4-7]，其出现弥补了传统形态学鉴定的不足。

本研究对2018年河南口岸病媒生物监测中发现的一种不常见麻蝇成虫进行形态与DNA条形码的鉴定，经业内相关专家鉴定复核，确定其为郭氏欧麻蝇(Sarcophagadepressifrons)。经查阅文献[8-15]，郭氏欧麻蝇为河南地区首次发现，为新记录的蝇种。现将其形态鉴别特征及DNA条形码记述如下, 并就防止病媒生物的扩散问题进行讨论。

1 材料与方法

1.1材料样本为2018年7月5日在新郑机场口岸区域监测到的蝇5只，其中4只(雌性3只，雄性1只)通过形态学比对进行鉴定；余1只(雌性)进行DNA条形码鉴定。

1.2形态鉴定4只蝇制成针插标本，使用超景深显微镜(型号：基恩士VHX-5000)进行检视。标本拍照留档，保存于郑州海关技术中心标本室。依据《中国蝇类》检索表[8]在三维显微镜下对蝇类进行形态学鉴定，并描述其形态特征。

1.3DNA条形码鉴定

1.3.1 基因组DNA制备 取蝇1条后足，按照Qiagen公司DNA提取试剂盒说明书进行基因组DNA提取，-20 ℃保存备用。

1.3.2 目的基因扩增 蝇类COⅠ 基因扩增引物上游序列：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游序列：5’-TAAACTTCAGGGTGAC CAAAAAATCA-3’，目的片段为658 bp，由Invitrogen 公司合成。PCR 反应体系(25 μL)： 10 μmol/L COⅠ上下游引物各1 μL，Premix TaqTM聚合酶12.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，混匀。扩增条件：94 ℃变性 3 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。毛细管电泳检测PCR产物后4 ℃保存。DNA提取试剂盒(QIAamp Viral DNA Mini Kit)和DNA Marker(800 bp)均购自凯杰公司，Premix购自TaKaRa公司。

1.3.3 序列比对分析和发育树构建 PCR产物送Invitrogen公司进行序列测定。用DNAStar[16]的SeqMan软件查看COⅠ基因序列峰值图质量，判断结果的可靠性。用DNAStar的EditSeq软件分析所得序列的碱基成分。将所得序列与GenBank[17]和BOLD[18]Systems v4中的序列进行比对，选取与所测序列同源性最高的5条郭氏欧麻蝇序列，根据比对结果选取亲缘关系较近的7条序列，以家蝇(Muscadomestica)为外群，使用Mega 7.0软件[19]的邻接法(NJ法)、最大简约法(MP法)、最大似然法(ML法)和最小进化法(ME法)构建系统发育树，并进行1 000次的自举检验。结合形态学鉴定结果和DNA条形码鉴定结果确定蝇种。

2 结果

2.1形态学鉴定结果对该蝇种的外部形态描述如下：体长6.0～11.0 mm。额宽约为眼宽的1/2。侧颜狭，侧颜鬃1行，细长。触角黑色，第3节长度约是第2节的1.25倍，触角的第3节具棕色粉被；触角芒为长而细的纤毛。颊高不超过眼高的1/3。下颚须黑色。前胸侧板中央凹陷处裸，中胸盾片的3黑色纵条和腹部棋盘状斑明显。后中鬃在小盾前1对，后背中鬃3对，均发达，腹侧片鬃1∶1∶1。r1脉上具小刚毛，2R5室开放。腹部第3背板具中缘鬃，第7、8合腹节后缘鬃长大；第5腹板无窗。雄性肛尾叶侧面观中间曲折向前，后面观在曲折处裂开；侧尾叶约为等边三角形。前阳基侧突末端尖而钩曲，背面有几根细毛；后阳基侧突与前阳基侧突相似但较前阳基侧突短，腹面有2根细长毛。膜状突不发达，侧阳体基部腹突侧叶发达，呈圆形，侧突尖细向前；侧阳体端部侧突呈卵圆形的匙状。雌性第6背板完整。见图1。

A：背面观；B：侧面观；C：正面观

2.2DNA条形码鉴定结果

2.2.1 COⅠ基因片段扩增 样品蝇基因组DNA经PCR扩增后毛细管电泳检测，可扩增出710 bp左右特异片段，与预期结果一致，见图2A。

2.2.2 扩增产物碱基成分分析 去除引物序列后目的片段大小为658 bp，没有缺失和插入。将该序列上传至GenBank，获取登录号：MN540957。碱基成分分析显示，A、G、T、C所占比例分别为37.69%、17.48%、28.42%和16.41%，(A+T)比例为66.11%，(C+G)比例为33.89%。

2.2.3 与NCBI和BOLD序列的比对结果 DNA测序结果经Seqman软件分析峰值图，没有杂峰干扰。经比对、拼接，去掉两端引物，处理后的序列与NCBI比对结果表明，该样本序列和郭氏欧麻蝇(登录号：KM497317)的COⅠ基因序列相似度为99.84%；与BOLD比对结果也显示与郭氏欧麻蝇的相似度高达99.84%(图2B)。

2.2.4 系统发育树的构建 由NJ法、MP法、ML法和ME法构建的发育树(图3)可见，4个拓扑结构整体一致，样本序列(GenBank登录号为MN540957)首先跟序列相似度最高的郭氏欧麻蝇KM497317(99.84%)、KM497320(99.69%)聚在一起，与另外3条郭氏欧麻蝇聚在一个大分支中，置信度高达100%，与所选用的其他麻蝇亚属共同聚成麻蝇属，麻蝇属明显和外群家蝇分开。DNA条形码鉴定本实验样本为郭氏欧麻蝇。相似度比较高的7条物种序列分别是金翅鬃麻蝇(S.seniorwhitei)、赤尾麻蝇(S.haemorrhoidalis)、巨麻蝇(S.caerulescens)、舞毒蛾麻蝇(S.schuetzei)、犁头亚麻蝇(S.aratrix)、野畔麻蝇(S.similis)、红尾麻蝇(S.africa)，家蝇(Muscadomestica)为外群(表1)。

图2 COⅠ基因PCR扩增后的毛细管电泳结果(A)和样本序列与BOLD的比对结果(B)

A：NJ法；B：MP法；C：ML法；D：ME法

表1 样本及所用序列信息

3 讨论

薛万琦等[8]的《中国蝇类》和范滋德[14]的《中国常见蝇类检索表》中，郭氏欧麻蝇隶属于双翅目麻蝇科麻蝇亚科欧麻蝇属，而在Pape[10]发表的著作中提出了麻蝇新分类系统，描述郭氏欧麻蝇隶属于双翅目麻蝇科麻蝇属欧麻蝇亚属。郭氏欧麻蝇(Sarcophagadepressifrons)分布于古北区和东洋区，是典型的古北区种类，主要分布于朝鲜、日本、意大利、瑞典、法国、德国等国家，国内主要分布于广东、北京、上海、江苏、辽宁、贵州、广西等地[8-11,13-14]，新郑机场发现该蝇类，丰富了该种群的分布资料。2018年7月5日在新郑机场口岸区域监测到5只郭氏欧麻蝇，之后又在河南地区的铁路货运口岸及洛阳机场口岸等地采集到87只，证实郭氏欧麻蝇在河南地区已确有分布。在《中国蝇类》[8]中，郭氏欧麻蝇(Heteronychiaquoifan，1964)被认为与主要分布于欧洲及苏联西伯利亚西部的H.Obscurata(rohd.，1937)极近缘，两者的关系尚待进一步研究。而在Pape[10]1996年发表的著作中，二者被认为是同物异名，且有效种名被统一修订为SarcophagadepressifronsZetterstedt, 1845。

麻蝇科的外部共同特征有：后足基节上部后表面有细的柔毛群，腹部有棋盘状斑。麻蝇属多数种类形态极为相似，通常依据雄性尾器鉴别，但雌性麻蝇的鉴别一直是一个技术难题[20]，即使经验很丰富的分类学家也很难区分雌性麻蝇[3，21]，目前还没有一个统一的分类标准[22]，如若标本残缺不全，形态鉴定更为困难，所以简便高效的物种鉴定技术很关键。COⅠ基因的保守度适中，同时又能保证足够变异，其序列本身很少存在缺失和插入，且很容易被通用引物扩增，适合用来进行物种的鉴定[21,23]。近年来，COⅠ基因已成功用于昆虫、鸟类、鱼类等动物的分类鉴定。在口岸病媒生物鉴定中，DNA条形码技术也成为传统形态学鉴定的有效补充，并获得广泛应用[24]。张明等[25]对麻蝇属54个物种的COⅠ基因片段进行了分析，证实该基因用于麻蝇属各亚属级阶元的分类有效。方义亮等[26]通过分析福建口岸截获的麻蝇亚科蝇种的DNA条形码，证实该技术在麻蝇亚科种类鉴定中可以作为形态学鉴定方法的重要补充。

本研究监测到的蝇种经过业内相关专家鉴定和形态描述，具有前胸侧板中央凹陷处裸，中胸盾片的三黑色纵条和腹部棋盘状斑明显，前阳基侧突末端尖而钩曲，侧阳体端部侧突呈卵圆形的匙状等主要鉴别特征。DNA条形码分析结果显示，所得COⅠ基因序列中(A+T)碱基比例为66.11%，有很明显的(A+T)碱基偏好性，跟之前的研究[27-29]一致。采用NJ法、MP法、ML法和ME法构建的系统发育树显示，4个拓扑结构整体上一致，样本序列(登录号：MN540957)与郭氏欧麻蝇聚在一起，置信度高达100%，与内群其他麻蝇亚属共同聚为麻蝇属，与其他研究[30-32]的结果一致。外群家蝇为独立的一支，置信度均已超过50%(已将80%以下数值隐去)，可信度较高。经NCBI、BOLD比对，同源性均为99.84%，线粒体基因的种内遗传距离通常为<1%，极少数>2%[5]，鉴定结果为郭氏欧麻蝇。

麻蝇跟人类的生活密切相关，是主要的寄生性蝇类之一[33-34]，其幼虫可寄生在双翅目、脉翅目等幼虫体内，影响其生存和繁殖[35]；也有许多种类的幼虫具有腐尸性和粪生性。麻蝇可传播蠕虫病、细菌性肠道疾病痢疾和伤寒、霍乱、脊髓灰质炎及其他病毒性肠道感染、结核病、寄生虫病等多种疾病，亦可引起人畜患蝇蛆症等，给人类健康带来极大的威胁[36]。随着全球经济一体化发展和国际间交往频繁，以及全球气候变暖和生态恶化，包括麻蝇在内的病媒生物的种类、分布和密度发生了很大变化，随之传播的疾病也出现了传播范围广、速度快、频次更高、强度增加的现象。麻蝇是国境口岸重点防控的对象之一。应加强口岸病媒生物检疫查验力度，重视病媒生物本底调查及本地区生物物种变化的监测，掌握本地生物种群情况, 建立本底资料, 尽早发现是否有入侵现象，以便实施有效控制。