大鼠牙胚外伤性和氟斑牙性釉质白垩斑酸蚀及冷光美白后微观观察

高 黎，刘 鑫，郭 姗，李艺博，张彦喜

1)郑州大学第一附属医院儿童口腔科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院口腔颌面外科 郑州 450052

釉质白垩斑是口腔临床常见现象，多见于特纳牙、氟斑牙等，尤其是上前牙唇面，对美观影响大，治疗比较棘手。冷光美白是治疗着色牙的常用方法，酸蚀是光固化树脂修复的重要步骤。冷光美白及酸蚀对外伤及氟斑牙性白垩斑的影响未见报道。本文通过扫描电镜、能谱分析观察外伤性和氟斑牙性白垩斑结构，以及酸蚀和冷光美白对其影响，为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物、材料和设备清洁级SD大鼠孕鼠(河南省实验动物中心)。一次性口腔器械盘(北京祥康科技有限公司)，氟化钠晶体(天津市北辰方正试剂厂)，酸蚀剂(德国贺利氏格鲁玛公司)，冷光美白仪、冷光美白凝胶(美国Beyond Technology公司)，30 g/L戊二醛溶液、无水乙醇(武汉赛维尔生物科技有限公司)。Nikon照相机、扫描电镜由郑州大学材料与工程学院提供。

1.2动物模型的建立从50只1 d龄幼鼠中随机选取10只不做任何处理，作为空白对照组(A组)。20只建立牙胚外伤模型(B组)[1]：用拉钩拉住下唇，暴露下前牙牙槽区，在下颌前牙区顺牙齿生长方向对下颌骨垂直施加10 N/5 mm2的力，4周后引颈处死。20只建立氟斑牙模型(C组)：大鼠3周龄时，与母鼠分笼，基础饲料及自来水适应性饲养1周后，自由饮用50 mg/L氟化钠溶液，8周后引颈处死。

1.3实验分组及处理选经1.2项处理后的3组大鼠下颌切牙各18颗，共54颗。随机分为9组，每组6颗。A0、B0、C0组：不做任何处理；A1、B1、C1组：酸蚀处理，牙齿表面均匀涂布体积分数37%的磷酸酸蚀剂，20 s后用蒸馏水反复冲洗，气枪吹干；A2、B2、C2组：冷光美白处理，牙齿表面均匀涂布体积分数35%过氧化氢冷光美白凝胶，用冷光美白仪连续光照30 min，蒸馏水反复冲洗，气枪吹干。

1.4各组大鼠下颌切牙的扫描电镜和能谱分析样本在无水乙醇中超声荡洗5 min，样本干燥处理后将牙齿用导电胶固定在载物台上，放入真空镀膜机中镀膜，用扫描电镜对牙釉质表面结构进行观察并拍照，测量牙釉质表面钙、磷元素含量。

1.5统计学处理采用SPSS 20.0对数据进行分析。对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验，结果符合正态性和方差齐性；应用单因素方差分析和LSD-t检验对不同处理方式大鼠下颌切牙钙、磷质量百分比能谱分析结果进行比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1实验动物模型下颌切牙大体标本见图1。

2.2未处理的大鼠下颌切牙扫描电镜和能谱分析结果见图2、表1。扫描电镜下：A0组大鼠下颌切牙表面平整光滑，无釉柱釉质完整。B0组大鼠下颌切牙表面无釉柱釉质层粗糙不平，有不规则裂隙及小的点状缺损。C0组大鼠下颌切牙表面无釉柱釉质点状、片状缺损。

A：空白对照组(牙齿表面光滑，有光泽，呈淡黄色)；B：牙胚外伤模型组(表面光滑，切端白垩色斑块，颈部淡黄色)；C：氟斑牙模型组(表面光滑，切端白垩色斑块，颈部棕黄色)

A：正常牙(×100)；B：正常牙(×500)；C：外伤牙(×100)；D：外伤牙(×500)；E：氟斑牙(×100)；F：氟斑牙(×500)

表1 未处理的大鼠下颌切牙钙、磷质量百分比能谱分析结果(n=6) %

2.3酸蚀处理后的大鼠下颌切牙扫描电镜和能谱分析结果见图3、表2。扫描电镜下：A1组大鼠下颌切牙表面釉柱结构清晰，排列整齐，呈有序的编织状，釉柱与柱间隙界限分明，釉柱尖端呈锥形；B1组釉柱整体仍呈编织状，排列轻度紊乱，釉柱边缘呈毛刺样改变，尖端失去规则的锥形形态；C1组釉柱失去编织状，与牙面呈一定角度单向排列，细小，边缘不整齐，尖端尖细。

A、B、C：正常牙(×600，×2 000，×5 000)；D、E、F：外伤牙(×600，×2 000，×5 000)；G、H、I：氟斑牙(×600,×2 000,×5 000)

表2 酸蚀处理后的大鼠下颌切牙钙、磷质量百分比能谱分析结果(n=6) %

2.4冷光美白处理后的大鼠下颌切牙扫描电镜和能谱分析结果见图4、表3。扫描电镜下：A2组大鼠下颌切牙釉质表面粗糙，有小而浅点状凹陷；B2组釉质表面有大面积小而深的凹坑状微孔，呈蜂窝状；C2组釉质表面部分区域呈点片状剥脱，边界不清，呈鳞屑状，其余区域釉质较为正常，两者呈不规则地图样交错。

A、B、C：正常牙(×600，×2 000，×5 000)；D、E、F：外伤牙(×600，×2 000，×5 000)；G、H、I：氟斑牙(×600,×2 000,×5 000)

表3 冷光美白处理后的大鼠下颌切牙钙、磷质量百分比能谱分析结果(n=6) %

3 讨论

3.1特纳牙[2]是指由于乳牙根尖周严重感染或乳牙外伤导致继承恒牙釉质发育不全。Silberman等[3]将特纳牙分为4种不同类型，主要为牙釉质变色和缺损。有学者[4]对犬翻瓣暴露恒牙胚，在恒牙胚上直接加力，发现能够有效对其切牙胚造成损伤。作者的前期研究[5]发现，对45 d龄犬乳牙齐龈挫入导致继承恒牙釉质发育不全的发生率高达85%。对于实验动物的选择，由于实验设计需要与氟斑牙形成对照实验，故本实验选择大鼠作为实验动物，而且大鼠牙齿的发生过程也使我们建模成为可能[6]：1 d龄时切齿正处于钟状晚期，而且下颌骨骨壁尚未发育完全，故选择对1 d龄大鼠下颌骨施加创伤性外力。大鼠建颌完成是在6周龄，可正常行使咀嚼功能，这一特点又保证了牙胚外伤的形成完全是由于外力对牙胚的损伤，而非进食其他事物引起。作者预实验发现，对1 d龄幼鼠暴露下前牙牙槽区，顺牙齿生长方向施加10 N/5 mm2的力，可成功建立外伤性特纳牙釉质发育不全动物模型。

3.2氟斑牙是牙釉质形成过程中过量摄入氟化物引起的牙釉质低矿化，导致釉质结构异常。组织学表现为表层下的釉质呈多孔性的矿化不良[7]。临床上常按其轻、中、重而分为白垩型(轻度)、变色型(中度)和缺损型(重度)3种类型，其中白垩型表现为牙面失去正常光泽，出现不透明白垩色斑块。对于动物模型的选择，学者们已成功应用氟化饮水的方法复制出理想的氟斑牙动物模型[6-9]。相较于犬和猴，大鼠具有牙齿发育时间短，且终生不断萌出的特点。有研究[1]表明，鼠切牙氟斑牙35 d更新1次，所以我们实验选择给予鼠氟化饮水1月，成功建立氟斑牙大鼠模型，其典型表现与以往研究结果相同。

3.3大鼠切牙表面釉质微观结构的扫描电镜观察

3.3.1 表面未处理 低倍视野下3组大鼠下颌切牙表面都有无釉柱釉质覆盖，这也解释了临床所见釉质虽表现为白垩斑，但表面仍光滑。郑旭等[10]研究显示，白垩斑病变部位多位于牙釉质表层内侧边缘，呈片状损害，表面牙釉质结构基本完整。高倍视野下3组结构略有不同：A0组表面无釉柱釉质完整；B0组表面无釉柱釉质部分覆盖，表面略粗糙，有裂纹；C0组表面无釉柱釉质部分覆盖，表面粗糙，有点状孔隙样凹陷。文献[11]报道，龋性釉质白垩斑的原因可能是釉质在细菌产酸的作用下脱矿，使得孔隙容积增大，孔隙中充满空气或水，这二者的折光率均低于釉质。由此推测，氟斑牙及外伤性白垩斑形成的原因可能是釉质釉柱不完整，裂纹及孔隙等改变了折光率所致。

3.3.2 酸蚀处理 去除表面无釉柱釉质后，3组结构明显不同。A1组釉柱结构清晰，排列整齐，呈有序的编织状，釉柱与釉柱间隙界限分明，釉柱尖端呈锥形。B1组釉柱结构与正常组相似，仍呈编织状排列，柱间隙增宽，边缘粗糙呈毛刺状。由此推测，牙胚外伤只影响釉质量的形成，而不影响釉质堆积方式及方向，不影响其结构，说明釉质的形成机制未发生改变。外伤引起釉质发育不全除直接损伤外，损伤相关分子模式机制可能也起重要作用。有研究[12-15]表明，创伤引起组织损伤的机制是作为损伤相关分子模式代表物质的HMGB1通过结合促进炎症的免疫受体，尤其是TLR4，引起核因子NF-κB的活化，使炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6分泌增加，从而引发局部组织炎症免疫反应。由此推测牙胚外伤引起釉质晶体细小是由于：牙胚组织细胞受到创伤，使正常存在于细胞内的损伤相关分子释放到细胞外，进入到组织间隙后，激活免疫细胞表面的PRRs，引起炎症反应，破坏了牙胚釉质分泌的有关细胞，继而引起牙胚釉原蛋白、釉蛋白、成釉蛋白等的表达异常，最后造成牙齿的釉质缺损。C1组釉柱晶体明显细小，排列方向单一，与切牙唇面呈一定角度单向排列，釉柱边缘不整齐，尖端明显变细，与张慧[16]研究结果相似。由此推测，引起氟牙症的高浓度氟不仅影响釉质形成的量，而且影响了釉质的沉积方式，导致釉柱单向排列而失去编织状结构。由于牙釉质晶体的发生、成长是由分泌到釉质基质中的蛋白质来执行[17]，孙宏晨等[18]研究显示，过量氟可引起分泌期及成熟期成釉细胞凋亡，使釉基质蛋白(EMDs)分泌减少且不能被充分降解，进而干扰釉质晶体的生长，导致釉质结构异常。EMDs主要包括釉原蛋白、成釉蛋白和釉蛋白。釉原蛋白在釉质晶体形态结构的形成过程中起着决定性作用，参与调控羟基磷灰石晶体的生长速度，调控晶体的生长方向，决定釉柱的结构[18]。其中成釉蛋白作为非釉原蛋白中含量最多者，成釉蛋白基因敲除的小鼠，表现为严重的釉质发育不全表型[19]。釉蛋白起维持和促进晶体生长作用[20]。作者的实验结果提示高浓度氟可通过影响釉基质蛋白的形成过程进而改变了氟斑牙釉质晶体的方向，这为以后进一步研究氟斑牙釉质发育不全的形成机制提供了新的思路。

3.3.3 美白凝胶处理 A2组牙齿表面轻微粗糙，无釉柱层未完全破坏，不影响正常结构，可快速再矿化，与Li等[21]实验结果相同；B2组釉质表面有小而深的蜂窝缺损；C2组釉质表面呈点片状剥脱，剥脱区边界不清，呈鳞屑状，有的区域釉质表面较为正常，两者相互间呈不规则地图样交错，其形态的改变同Wang等[22]实验结果相同。作者的实验结果提示强氧化剂对A2组及C2组影响较轻，对B2组影响较为明显。作为冷光美白剂主要有效成分的过氧化氢具有强氧化性，以釉质和牙本质小管为通道，能够快速与有机成分结合[23-24]。由于外伤造成釉柱细小而柱间质相应增加，柱间质有机成分含量高，所以冷光美白剂对B2组釉质结构影响较大。这提示在临床上对着色牙进行冷光美白时，对于外伤性着色牙齿应注意保护白垩斑区域。

3.4大鼠切牙表面釉质的能谱分析

3.4.1 表面未处理 A0组钙磷含量>B0组>C0组，且A0组与C0组、A0组与B0组之间差异有统计学意义，可能是由于A0组釉质表面无釉柱釉质层完整，B0组及C0组表面无釉柱釉质有缺损，而表层无釉柱釉质的钙磷含量高于深层釉质，且C0组表层釉质剥脱更严重。

3.4.2 酸蚀处理 3组钙磷含量均升高，且组间差异无统计学意义。可能是较短的酸蚀时间，仅去除无釉柱釉质并脱去釉柱间隙内的有机成分，而保留了釉柱结构，因此3组钙磷含量均升高。3组间差异无统计学意义，说明氟斑牙和外伤所致的白垩斑区釉质晶体的元素成分与正常牙齿相同。

3.4.3 冷光美白处理 正常牙齿冷光美白后钙、磷含量下降，这与Cavalli[25]、Sulieman[26]等学者的研究结果一致，可能与过氧化氢使釉质表面轻度脱矿有关。B2组和C2组冷光美白处理后钙、磷含量均升高，且B2组白垩斑钙、磷含量高于C2组。由于过氧化氢[27]是一种活泼的强氧化剂，能形成超氧化物自由基，其有不对称电子，非常不稳定，易与其他原子或分子结合，可切断牙齿着色釉质有机成分中未饱和的二价键，并与之结合，使其氧化分解为小分子物质，最终变成CO2和H2O，并发散出牙体表面，所以强氧化漂白剂过氧化氢主要作用于牙齿中的有机质成分。Kawamoto等[28]研究证明，强氧化剂对羟基磷灰石(HA)无破坏作用，但能降解牙本质中的有机成分。由于外伤性白垩斑区域釉柱细小，相应有机成分多，所以导致外伤性白垩斑区钙磷含量明显升高；而氟斑牙性白垩斑虽然釉柱方向改变，但釉柱的量减小程度较外伤者小，所以其钙磷含量有所升高但不如外伤者升高程度大。

综上所述，外伤及氟斑牙性白垩斑无釉柱釉质覆盖不全。外伤性白垩斑釉柱变小，但排列方式未发生改变。氟斑牙性白垩斑釉柱排列方向单一且失去正常编织状。冷光美白对两种白垩斑区域均有影响，且对外伤性者影响更大。因此，在临床上对外伤和氟斑牙性着色牙进行冷光美白时，应避开牙齿白垩斑区域，以免造成白垩斑区釉质进一步破坏。