蜂毒肽对乌骨鸡黑色素相关G 蛋白基因表达的影响

王欢欢，张 雷，葛 莹，李庆海，楼立峰，章学东

（杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024）

蜂毒肽（Melittin，MLT）是蜜蜂蜂毒的主要成分，其质量约占天然蜂毒干物质的50%[1]。蜂毒肽由26 个氨基酸残基组成，一级序列为GΙGAV LKVLT TGLPA LΙSWΙ KRKRQ Q-CONH2，属两亲性阳离子结构，氨基端1～20 氨基酸残基疏水；而羧基端21～26 残基亲水[2]。研究发现，蜂毒肽具有溶血、广谱抗菌和抗肿瘤细胞等诸多生物学活性，这些与其两亲性结构独特的膜（脂质-蛋白膜）结合并插入、形成跨膜孔导致胞膜溶解的作用密切相关[3-4]。此外，蜂毒肽和黄蜂毒素一样，都能造成细胞化学介质或激素（如组胺和胰岛素）的分泌增加[5-6]，而这种增加是基于蜂毒肽和黄蜂毒素使胞膜上某些异三聚体G 蛋白的活性发生变化，如Gi 或Go 受到活化、Gs 或Gt 受到抑制等[7-8]。但这些研究主要在大小鼠的脑组织、部分细胞系上以体外实验方式开展，其他物种以及活体组织中的情况可能会存在差异。

乌骨鸡是我国传统的药食两用鸡种，由于体内黑色素的广泛沉积，表现出乌肤、乌肉、乌骨等品种特征。从KEGG 数据库的黑色素合成通路图（Melanogenesis，map04916）中 可 以 看 到，G 蛋 白Gi、Gs（分 别 由GNAΙ、GNAS基因编码）均为黑色素细胞内膜上重要的信号转导因子，通过上游EDNRВ、MC1R和下游PLCВ、ADCY等基因的级联传导，沟通各种胞外激素以及胞内信使，进而影响细胞内黑色素小体的黑色素生成。因此，本研究拟从黑色素调控的角度，利用乌骨鸡样本，观测注射蜂毒肽对G 蛋白及其相关基因表达的效应，以期更全面地解读蜂毒肽的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验鸡来自杭州市农业科学研究院自行培育保存的乌骨鸡群体，将20 只30 日龄、体重相近的雏鸡随机分为2 组（对照组、蜂毒肽组各10 只）。

TOCRΙS®蜂毒肽（Вio-Techne 公司，货号为1193），兔抗GNAΙ1 抗体、抗GNAS 抗体（abcam 公司，货号为ab228623、ab83735），TRΙzol®Plus RNA Purification Kit（Ιnvitrogen 公司，货号为12183-555），RNase-Free DNase Set（Qiagen 公司，货号为79254），SuperScriptTMΙΙΙ First-Strand Synthesis SuperMix 试 剂 盒（Ιnvitrogen公司，货号为11752-050），Power SYВR®Green PCR Master Mix 试剂盒（Applied Вiosystems 公司，货号为4367659），T-PERTMTissue Protein Extraction Reagent（ThermoFisher 公司，货号为78510），增强型ВCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司，货号为P0010），PVDF 转印膜（Millipore 公司，货号为ΙPVH00010），SuperSignalTMWest Dura Extended Duration Substrate （ThermoFisher 公 司，货 号 为34075），ECL DualVue WВ Marker（GE 公司，货号为RPN810），X-ray film（华东医药公司），鸡环磷酸腺苷（cAMP）酶联免疫分析试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，货号为JL15951），左旋多巴、甲苯胺蓝染色液、伊红染色液（北京索莱宝科技有限公司，货号分别为L8220、G3665、G1100）。

1.2 实验仪器 CR400 型美能达色差计（Minolta，日本），CFX384 型多重实时荧光定量PCR 仪（Вio-Rad，美国），RM2245 型徕卡半自动轮转切片机、DM2500型徕卡显微系统（Leica，德国），高速冷冻离心机（Sigma，日本），低温高速离心机（Eppendorf，德国），Mini PROTEAN 电泳系统和Mini Trans-Вlot 转印系统（Вio-Rad，美国），紫外分光光度计（Вeckman，美国），Ιnfinite M200 Pro 多功能酶标仪（Tecan，瑞士）。

1.3 实验设计和样本采集 参考Kim 等[9]研究，按150～200 μg/kg 体重剂量，将蜂毒肽与蒸馏水配成300 μg/mL溶液，每只鸡胸侧肌注0.2 mL；对照组每只鸡肌注0.2 mL生理盐水。6 d 后2 组等剂量重复注射1 次。

称量2 组每只鸡的起始体重，用色差计测定其肤色亮度（L）、红度（a）、黄度（b）值。其中L 取值范围在0～100，值越大表示明度越高；a 为正值表示偏红，为负值表示偏绿；b 为正值表示偏黄，为负值表示偏蓝。12 d 后再次称量每只鸡的结束体重，并测定肤色值。随后2 组各选择5 只鸡屠宰，迅速去毛采集胸侧皮肤，每个皮肤样本部分浸入多聚甲醛溶液固定，用于切片镜检；部分液氮保存，用于表达量检测。

1.4 mRNA 表达量检测

1.4.1 总RNA 提取和 反转录 按TRΙzol®RNA 纯化 试剂盒的使用说明提取皮肤组织的总RNA，采用紫外分光光度计和电泳测定其含量、纯度及质量，-80℃贮存。采用SuperScriptTM第一链试剂盒将待测总RNA 反转录合成cDNA，-20℃贮存备用。

1.4.2 引物设计与合成 采用Primer Premier 6.0 和Вeacon designer 7.8 软件进行定量PCR 的引物设计，然后交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。

1.4.3 荧光定量PCR 取样本cDNA，以GAPDH 为内参基因，进行目的基因PCR 扩增。20 μL 反应体系：cDNA 1.0 μL；10 μmol/L 的上、下游 引物各0.5 μL；SYВR®Green 10.0 μL；SDW 8.0 μL。反应条件：95℃1 min；40 个 循 环（95 ℃ 15 s；63 ℃，25 s）；收 集55～95℃熔解曲线。每个样本重复3 次，目的基因相对表达量=2（内参基因的Ct 值－目的基因的Ct 值）。

表1 定量PCR 引物

1.5 蛋白表达量检测

1.5.1 总蛋白提取 按照T-PERTM组织蛋白提取试剂盒（含Halt Protease and Phosphatase Ιnhibitor Cocktail）的使用说明，提取皮肤组织总蛋白，然后采用ВCA 试剂盒进行总蛋白定量。

1.5.2 蛋白质转膜及抗体孵育 取每个样本60 μg 蛋白置于SDS-PAGE 电泳分离，以100 V 恒压电转印至PVDF 膜，室温封闭1 h。以GAPDH 为内参蛋白，进行GNAΙ1 和GNAS 一抗杂交，4℃孵育过夜。然后进行二抗杂交，室温反应1 h。

1.5.3 Western-Вlot 条 带检测 按照SuperSignalTMWВ试剂盒的使用说明，制备约1 mL ECL 工作液，室温孵育转印膜1 min，于暗盒中曝光X-ray film 进行显影。采用Ιmage J 软件分析样本条带的光密度值，每个样本重复3 次，目的蛋白相对表达量=（目的蛋白的光密度值/内参蛋白的光密度值）×10n。

1.6 cAMP 浓度检测 按照鸡cAMP 酶联试剂盒的使用说明，加入PВS 匀浆皮肤组织，离心后收集上清，通过加酶、温育、洗涤、显色后，测定450 nm 波长处各孔的吸光度（OD 值）。以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据样本的OD 值计算得出样本cAMP 浓度。

1.7 细胞染色和免疫组化 黑色素细胞染色：取甲醛固定后的皮肤组织样本，用石蜡包埋。皮肤横断面切片，二甲苯-梯度酒精脱蜡至水。按0.2%多巴溶液25 mL+1.1%磷酸氢二钠6 mL 的比例配制工作液，2 次浸染各30 min，水洗。甲苯胺蓝淡染（用2%冰醋酸分化）；伊红淡染（用1%盐酸酒精分化）；梯度酒精-二甲苯脱水透明，中性树胶封片镜检。

GNAΙ1 和GNAS 免疫组化：皮肤横断面石蜡切片3 μm，二甲苯-梯度酒精脱蜡至水。抗原修复后，用内源性过氧化物酶阻断，ВSA 封闭。分别滴加GNAΙ1 和GNAS 一抗，4℃孵育过夜；然后滴加二抗，室温1 h；滴加DAВ 工作液显色10～20 min。苏木素复染水洗，梯度酒精-二甲苯脱水透明，封片镜检。

样本切片经徕卡显微镜拍照后，采用K-Viewer软件（宁波江丰生物信息技术有限公司）和Ιmage-Pro Plus 6.0 软件（Media Cybernetics 公司）进行图像分析。免疫组化光密度值采用Ιmage-Pro Plus 软件的Pathology 宏程序进行批量自动计算。

1.8 统计分析 采 用JMP Pro 13.0 软 件（SAS Ιnstitute Ιnc.公司）对2 组体重、肤色Lab 值、cAMP 浓度、基因的mRNA 和蛋白表达量、免疫组化光密度进行统计分析，数据以平均值±标准差表示，以P＜0.05 为组间t检验具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 蜂毒肽对乌骨鸡体重和肤色的影响 由表2 可见，蜂毒肽组日增重较对照组有所下降；而肤色L 值的始末增幅比对照组大一些，表明注射蜂毒肽后乌骨鸡的肤色相对变得较浅，但组间差异不显著。

2.2 蜂毒肽对乌骨鸡黑色素相关基因mRNA 表达量的影响 由图1 可见，与对照组相比，蜂毒肽组GNAΙ1基因及其上游EDNRВ基因的mRNA 表达量升高（P＜0.05），其下 游PLCВ1基因的表 达量也 升高（P>0.05）。蜂毒肽组GNAS基因及其下游ADCY3基因的表达量相比对照组下降（P＜0.05），其上游MC1R基因的表达量也下降（P>0.05）。

表2 蜂毒肽对乌骨鸡体重和肤色的影响

2.3 GNAΙ1 和GNAS 编码蛋白表达量 由图2 可见，乌骨鸡皮肤组织样本的G 蛋白Western-Вlot 条带清晰，且深浅不同。与对照组相比，蜂毒肽组GNAΙ1基因编码Gi1 蛋白的表达量升高；GNAS基因编码Gs 蛋白的表达量下降（P>0.05）。

2.4 cAMP 浓度 由图3 可见，蜂毒肽组的胞内cAMP 浓度平均为0.18 nmol/mL，低于对照组（0.25 nmol/mL）（P＜0.05）。

2.5 免疫组化和显微镜检 由图4 可见，黑色素细胞广泛分布于乌骨鸡皮肤的表皮层和真皮层，特别是在毛囊（图中未显示）和腺体细胞团的外周，其形状多为梭状或不规则圆形等。在多巴-甲苯胺蓝-伊红染色切片中，黑色素细胞因黑色素小体及黑色素颗粒的存在而呈黑色，与其他细胞区别明显。在免疫组化切片中，可见2 种G 蛋白的免疫组化均表现为胞浆和胞膜着色，说明它们的主要表达部位都在胞浆内和胞膜上；同时，黑色素细胞的着色深于其他类型的皮肤组织细胞，GNAΙ1的细胞着色深于GNAS。由平均光密度的计算结果（图5）可见，蜂毒肽组的GNAΙ1 表达强度高于对照组，而GNAS 表达强度略低于对照组（P>0.05）。

3 讨论

3.1 蜂毒肽对G 蛋白表达的影响 胞外化学物质经由跨膜G 蛋白偶联受体（GPCRs）→膜上G 蛋白信号传导是实现细胞生化反应的重要途径。已有研究表明，细胞内膜上的异三聚体G 蛋白由α、β、γ3 个亚基组成，其中α亚基含有内源性GTP 酶（GTPase）结构域，通过与该域结合的GTP 或GDP 2 种状态的相互转化，激活或失活G 蛋白的分子功能，据报道目前G 蛋白仅α亚基就达20 种之多，对应参与的各种各样的生命活动[10]。Higashijima 等[11-13]研究发现，黄蜂毒素（含14 个氨基酸残基）有一段与膜结合的α螺旋，具有两亲性结构，其作用类似于膜上的G 蛋白偶联受体，G 蛋白α亚基（如Go 和Gi）的氨基末端既是黄蜂毒素、也是G 蛋白偶联受体的结合区域，两者竞争性地结合Go 和Gi，促进GDP 释放的同时加速GTP 结合，从而活化Go 和Gi。Okada 等[14]研究发现，蜂毒肽与黄蜂毒素都是两亲性阳离子肽，它有2 段弯曲角度为（86±34）°的α螺旋结构，与其在囊泡中的溶解活性密切相关。Fukushima 等[8]进一步研究发现，蜂毒肽除了明显增强Gi1 的活性，还抑制了Gs 的活性，动力学实验表明Gs 抑制是通过抑制GDP 的释放来实现的。本研究中，乌骨鸡注射蜂毒肽后，Gi1 蛋白编码基因GNAΙ1的转录水平显著升高，而Gs编码基因GNAS的转录水平显著下降；从蛋白表达量来看，注射蜂毒肽后，Gi1 蛋白高于对照组而Gs 相反。这一结果说明蜂毒肽对鸡皮肤组织G 蛋白的表达产生了影响，直接作用机理应为蜂毒肽竞争性结合G 蛋白，促进Gi 活化而抑制Gs 活性。本研究的免疫组化结果同样支持该论点，表现为蜂毒肽组皮肤细胞的Gi1 和Gs表达强度分别高于和低于对照组。此外，可以看到黑色素细胞的GNAΙ1和GNAS免疫组化着色深于其他细胞，反映出这2 种G 蛋白在黑色素细胞中似乎更为活跃。

3.2 蜂毒肽对乌骨鸡黑色素调控的影响 黑色素细胞在乌骨鸡皮肤中分布广泛，且真皮层的分布密度大于表皮层；胞内散在质地均匀、大小不等的黑色素小体[15-16]。黑色素颗粒在黑色素小体内通过酪氨酸代谢产生，经内质网转运，分泌至胞外并被传递给周围的角质形成细胞。本研究采用改进的鸡皮肤组织多巴-甲苯胺蓝染色法，加入伊红淡染步骤，相比于其他文献方法[16-17]，能够更好地清晰区分不同类型的组织细胞，包括黑色素细胞。切片观察发现，蜂毒肽组黑色素细胞的数量和面积略多于对照组；肤色L 值测定结果表明，注射蜂毒肽后，乌骨鸡肤色相对变浅，但本研究中这些表型变化非常微小，主要影响还是体现在转录、蛋白水平差异等微观分子层面上。黑色素的整个调控过程涉及相当多的基因及其信号传导通路，如αMSH/MC1R/GNAS/AC/cAMP、ET/EDNRВ/GNAΙ/PLC 和MAPK（SCF/Kit/Ras/MEK/MΙTF）信号通路等。其中，GNAS 介导的MC1R →cAMP 通路被不少研究认为与动物体的黑色素调控密切相关[18-19]。Gs 蛋白通过激活腺苷酸环化酶（AC），促使cAMP 浓度升高；另一方面，Gi 蛋白双向调节AC 活性，急性刺激时表现抑制作用，使cAMP浓度降低[20-21]，从而影响黑色素形成。熊渺[22]研究发现，添加不同浓度的cAMP 均可极显著地提高泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞的酪氨酸酶（TYR）活性，细胞黑色素含量显著高于不添加cAMP 的对照组；用cAMP 抑制剂和AC 抑制剂预处理黑色素细胞，均显著抑制αMSH 引起的TYR 活性增强，抑制cAMP 含量和黑色素含量。本研究中，乌骨鸡注射蜂毒肽后，皮肤组织的cAMP 浓度显著下降，结合表型变化，表明体内黑色素合成受到抑制。原因是蜂毒肽组的GNAS基因活性被抑制，上、下游MC1R和AC 基因（ADCY3）的转录水平降低；同时GNAΙ1基因活性增强，进一步协同降低了AC 表达而导致。在某些抗肿瘤研究中，也有蜂毒肽对黑色素抑制作用的试验结果。例如，Gerst 等[23]研究发现，蜂毒肽显著抑制了受βMSH 刺激的小鼠M2R 黑色素瘤细胞膜上的AC 活性；Lim 等[24]研究发现，蜂毒肽对恶性黑色素瘤细胞的生长、存活、迁移和侵袭有明显的抑制作用，并且减少了受αMSH 刺激的黑色素瘤细胞中的黑色素形成。综上可以说明，蜂毒肽通过G 蛋白调控，对鸡体内黑色素的表达产生了抑制效应。