经典型BCR-ABL1阴性MPNs患者JAK2、CALR及MPL基因突变检测及临床分析

李桂芳 刘会兰 耿良权 皖湘 徐修才 孙自敏 张世阳

按WHO2 0 1 6标准，经典型骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPNs）包括BCRABL1融合基因阳性的慢性粒细胞白细胞（chronic myeloid leukemia，CML）、真性红细胞增多症（poly-cythemia vera，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）和原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）等疾病，其中PV、ET和PMF三种类型被称作BCR-ABL1阴性的经典型MPNs，是一类起源于造血干细胞的髓系肿瘤，主要表现为一系或多系髓细胞（包括红细胞、血小板或白细胞等）过度增殖，外周血成熟血细胞细胞明显增多及肝脾肿大，临床上易发生血栓、出血及其他心脑血管事件，可伴有体重下降、皮肤瘙痒、性功能障碍、腹部不适、骨痛、发热等体质性症状，以及向急性髓系白血病转化、PV及ET有向骨髓纤维化（MF）转化的潜能[1，2]。自2005年Baxter等对MPNs患者中Janus激酶（Janus kinase，JAK）2 V617F突变的首度发现以来，随着测序等分子生物学技术的进展，JAK2基因第12号外显子、TPO受体基因（myeloproliferative leukemiavirus oncogene，MPL）和钙网蛋白（calreticulin，CALR）等驱动基因突变以及ASXL1等非驱动基因突变的陆续发现，逐步改变了人们对BCR-ABL1阴性的经典型MPNs临床和生物学特征的认识。新版WHO诊断标准依据驱动基因突变的检测，改进了对经典型MPNs形态学特征的理解及各亚型MPNs诊断标准的修订，但相比较于BCR/ABL1阳性的CML来说，因各中心对MPN驱动基因等检测项目开展的时间不一或检测项目不完全，国内对BCR/ABL1阴性MPNs的规范化诊治和基础研究还相对落后，本文通过对单中心2年连续门诊诊治的126例BCR-ABL1融合基因阴性的经典型MPNs患者的JAK2、CALR、MPL基因突变情况检测结果及病史分析，初步探讨驱动基因突变与BCR-ABL1融合基因阴性的经典型MPNs患者外周血细胞计数、年龄和血栓事件发生等的关系，以改进对经典型MPNs各亚型诊断进一步深入认识和治疗参考。

资料与方法

1 一般资料 回顾性分析了2017年7月至2019年7月就诊于中国科技大学附属第一医院（安徽省立医院）门诊及住院的126例BCR-ABL1融合基因阴性的经典型MPNs患者，其中男64例，女62例，中位年龄60（13～89）岁；PV42例，ET69例，PMF15例。所有患者按照2016年WHO[3]给出的PV、ET和PMF诊断标准，完成对于基因JAK2、CALR、MPL的检测，其中JAK2基因包含JAK2V617F、JAK2外显子12位点N542_E544del和K539；CALR基因包含CALR外显子9位点L367和K385；MPL基因外显子10位点W515和S505N。统计患者门诊病历初诊血细胞计数、患者个人基本信息以及血栓事件发生情况等。

2 研究方法

2.1 实验室检查及临床病例统计：抽取患者外周血进行血细胞计数、JAK2、CALR、MPL基因等检查。同时统计患者性别、年龄、血栓事件发生情况等基础信息。

2.2 基因检测：所有患者均留取外周血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，4℃保存，ABI PRISM荧光PCR检测仪、Stratagene Mx3000p荧光PCR检测仪扩增，反应条件为42℃，5 min，94℃预变性3 min，（94℃，45 s；60℃，80 s），共计40个循环，分析检测JAK2、CALR、MPL基因突变情况。

3 统计学处理 应用SPSS22.0软件，计量资料分析采用t检验，对患者血栓发生情况进行χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 患者基因突变数据统计结果分析 126例BCRA B L1融合基因阴性的经典型M P N s患者中，JAK2 V617F、CALR和MPL基因突变频率分别为77.78%（98/126）、13.49%（17/126）和0.79%（1/126），未发现有2种突变同时出现。其中JAK2 V617F、CALR及MPL三种突变全阴性患者占6.3%（8/126）。PV中JAK2 V617F阳性突变率为95.24%（40/42），有2例（4.76%）发现JAK2外显子12框内缺失突变；ET中JAK2 V617F、CALR及MPL突变率分别为71.01%（49/69）、20.29%（14/69）和1.45%（1/69）。PMF中JAK2 V617F和CALR突变率分别为60%（9/15）和20%（3/15），无MPL外显子10突变发现，见图1。

JAK2 V6 1 7F突变阳性的患者中，PV及ET的外周血白细胞和血小板计数高于阴性患者（P＜0.05）。ET中CALR突变阳性的年龄显著低于JAK2/MPL/CALR三阴性患者（P＜0.05），而JAK2 V617F突变阳性患者年龄大于CALR突变阳性患者（P＜0.05）、血红蛋白计数显著高于JAK2/MPL/CALR三阴性表达（P＜0.05）。PMF患者中JAK2 V617F突变阳性的白细胞计数高于三阴性患者（P＜0.05），见表1、2 。

表1 PV中JAK2 突变与临床特征分析

表2 ET中JAK2 V617F、CALR突变、MPL突变与三阴性突变临床特征分析

2 血栓栓塞发生情况 血栓事件总发生率为29.37%（37/126），其中PV组为33.33%（14/42），ET组27.54%（19/69），PMF组26.67%（4/15）， 三组间无统计学差异（P=0.103）。61例年龄≥60岁患者中有25例发生血栓事件（40.98%），65例年龄＜60岁患者中有12例发生血栓事件（18.46%），两组间比较有统计学差异（P=0.015）。JAK2 V617F阳性的血栓发生率显著高于阴性（P=0.037），血栓组中WBC、PLT、纤维蛋白原（Fb）较非血栓组明显升高（P＜0.05） ，见表3 。

讨 论

BCR/ABL1阴性的经典型MPNs是一组恶性克隆性疾病，发病高峰年龄大多在50～70岁之间，即常见于中老年患者，MPN病症进展演变或有以下几个过程：①发生出血与血栓等并发症，②相互演变即ET或PV可以转成MF，③进展为急性白血病（MPNBP），确诊后第一个10年内PMF转成MPN-BP概率为10%～20%；PV为2.3%；ET为1%。对MPN的及时诊断和治疗将有利于降低血栓等并发症的发生，延长寿命和改进生存，JAK2、CALR及MPL等驱动基因突变的检测更易识别MPNs和继发性血细胞增多等疾病，在ET和PMF中，三阴性突变是指JAK2、MPL及CALR突变均检测不到[4]，发生率约占10%～15%。

表3 MPN中血栓与非血栓患者V617F、年龄、外周血细胞及Fg关系分析

本文得出PV中JAK2 V6 1 7F阳性突变率为95.24%，ET中JAK2 V617F突变率为71.01%，PMF中JAK2 V617F突变率为60%，ET与PMF患者JAK2 V617F基因突变率与国外研究案例结果接近[5，6]，2017年郦梦云等[7]对1 648例患者进行分析，得出JAK2 V617F突变在PV、ET、PMF患者中突变率分别为92.7%，78.1%，81.3%。本文得出结论与国内外数据一致[8，9]。JAK2 V617F突变阳性的PV及ET患者中，外周血白细胞和血小板计数高于JAK2 V617F阴性患者，与Rumi E[10-12]等学者在2014年通过对大量临床数据研究结果一致。

本研究发现PV患者中存在JAK2 V617F突变（95.24%）和外显子12突变（4.76%），未发现野生型突变，而现有研究证明PV患者仅存在JAK2 V617F突变或其他功能相似的突变[2]，JAK2突变阴性的病例少见报道[13]，机制有待进一步阐明。本研究结果发现ET患者存在JAK2 V617F突变（71.01%）、CALR突变（20.29%）和MPL（1.45%）突变，未发现三种突变同时出现，与Tefferi A[14]等文献报道结果一致，该研究发现CALR突变率接近24%。研究发现CALR基因突变不发生于PV，多在20%～25%的ET及PMF中被检测到[15]。本研究发现JAK2 V617F突变阳性患者年龄大于CALR突变阳性患者，与Szuber N等[16]报道一致。ET患者中JAK2 V617F突变阳性的血红蛋白水平显著高于三阴性表达（P＜0.05），与国外数据相似[6，17]。

本研究发现PMF患中有JAK2 V617F（60%）和CALR突变（20%），未发现MPL外显子10突变，与MAP-Soares等报道结果一致[13]，该研究发现PMF患者JAK2 V617F和CALR外显子9突变率分别为60.8%和23.5%。Rumi等[17]发现，CALR突变患者比三阴性患者年龄更轻，三阴性患者中年龄偏高、血红蛋白计数较低，与本研究结论一致。PMF患者中JAK2 V617F突变阳性的白细胞计数高于三阴性患者（P＜0.05），与国外报道一致[6]。

WHO2016诊断分型标准中， PMF分为明显的PMF和早期PMF即pre-PMF，pre-PMF特点为中性粒细胞和非典型巨核细胞进行性增加，以及巨核细胞异型性包括：云雾状和泡状核。大部分pre-PMF患者表现为原发性血小板增多，故其常可与ET混淆但预后比ET更差，骨髓活检是鉴别该两种MPN最重要的标准。本研究标本量较少，未发现pre-PMF病例。

Barbui T等研究发现[18]，血栓事件在ET及PV患者中发生率分别为12%～39%和11%～25.7%。本研究中发生血栓患者37例，其中PV17例，ET15例，PMF5例。Nangalia J[19，20]等发现，JAK2V617F突变阳性的患者血栓发生率更高，该结果与本研究结果完全吻合。本次研究中发现年龄≥60岁患者血栓发生率明显升高，同时发现血栓组较非血栓组患者WBC、PLT及Fb明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。JAK2 V617F阳性的血栓发生率显著高于阴性，故对MPN患者，若发现JAK2 V617F阳性，尤其是有年龄≥60岁、WBC、PLT及Fb计数偏高的因素，临床上应加强监护，完善下肢血管彩超等检查，综合评估病情后早期抗凝治疗，尽可能改善患者生活质量，延长生存时间。

随着对MPNs研究的不断进展，目前发现IZF1、TP53、TET2、ASXL1、IDH1/2和EZH2、IKZF、SRSF2等[21]MPN非驱动基因突变常与驱动基因突变共同作用而导致MPN的发生发展，这些新增加的与年龄相关的髓系基因突变常常提示MPN向MF或急性白血病转化倾向，预后不良，本次研究未进一步分析非驱动基因的情况，今后开展这些非驱动基因突变检测将更有利于帮助预后判定及区别不同亚型的MPNs。此外，本研究未对研究对象进行生存分析，由于大部分数据来源于门诊患者，受依从性、地域、经济状况等限制，随访较为困难，为本次研究不足之处，今后的研究将从以上几点中获取经验，细化患者信息随访，扩充研究基因范围，扩大样本量等，更加全面的分析驱动基因和非驱动基因的临床意义及对于疾病生存时间之间的关系。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突