HPA-1-6/17基因多态性与青岛市血小板减少症遗传易感性的关系分析

成枫 许宏 肖淑欣 赵洪国

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）又称为血小板减少性紫癜，是临床常见的出血性疾病之一，其治疗手段主要依赖激素治疗，但效果较差，且复发率高[1]。作为自身免疫性疾病，ITP发病机制可能与机体免疫功能紊乱有关。研究认为，机体免疫功能紊乱可导致产生血小板表面糖蛋白自身抗体，抗原抗体结合后，单核巨噬细胞系统激活，最终导致血小板被破坏，出现血小板减少[2]。随着分子生物学技术的发展，人们发现免疫遗传学在ITP发病中发挥重要作用。已有研究表明，ITP发病可能与血小板特异性抗原（human platelet alloangtigen，HPA）基因多态性有关[3]。HPA是血小板膜糖蛋白上的特异性抗原表位，至今已有34个HPA被确定，在临床上研究较多的为HPA-1～17bw，其中除了HPA-14bw多态性表现为3个碱基缺失，其他抗原均为单核苷酸多态性（SNP）[4]。本研究通过青岛市地区ITP患者与正常人群HPA1-6及HPA17抗原基因多态性，旨在研究其与当地人群ITP发生的关系。

资料与方法

1 临床资料 选取2013年～2016年青岛大学附属医院确诊收治的ITP患者1 2 6例为研究对象，其中男4 5例，女8 1例，年龄1 8～7 4岁，平均年龄（42.7±15.8）岁，患者家族三代以内为常驻青岛市区及周边区县汉族人群。纳入标准：①患者诊断符合ITP诊断标准[5]；②患者未接受血小板输注治疗；③患者未使用免疫抑制剂或激素治疗，或已停止药物治疗1个月以上；④患者及家属签署知情同意书。排除标准：①资料不全，不配合治疗患者；②合并甲状腺疾病、淋巴系统增殖性疾病患者；③血栓性血小板减少紫癜患者，或是由药物引起的血小板减少患者；④白血病、结缔组织经等其他可引起血小板减少的疾病患者。选取我院同期健康体检者120例为对照组，其中男性46例，女性74例，年龄18～72岁，平均年龄（43.7±14.7）岁，家族三代以内均为常住青岛市区及周边区县地区人群。两组年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准。

ITP诊断标准[5]：多次诊断化验结果显示血小板减少；脾脏不肿大或轻度肿大；骨髓检查发现巨核细胞增多、有成熟障碍，同时满足以下任何一项患者：①可排除继发性血小板减少；②切脾治疗有效；③血小板相关免疫球蛋白（platele associated immunoglobulin，PAIg）增多；④PAC3（platele associated complement 3，PAC3）增多；⑤泼尼松治疗有效。

2 方法

2.1 样本采集 两组受试者均空腹采取肘静脉血5 mL，加入乙二胺四乙酸二钾（EDTA-2K）抗凝剂，充分混匀。–20℃保存待检。

2.2 基因组DNA提取 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取基因组DNA。操作步骤严格按照说明书进行。

2.3 PCR-SSP基因分型 根据GenBank序列信息和公开数据设计合成HPA1-6及HPA17基因分型引物，引物序列见表1。本研究选取人类生长激素（HGH）基因的保守片段为内参，PCR反应体系为27 μL，模板DNA 2 μL，Taq酶0.5 μL，含有基因分型引物及内参引物的混合扩增反应混合液24.5 μL，93 ℃变性3 min，93 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环，72 ℃延伸30 s。电泳凝胶成像记录。

2.4 结果判断 每孔均应出现内参条带，在相应电泳位置上出现特异性条带认为有相应等位基因，判为阳性；只有内参条带，则无等位基因，判为阴性；若两者均未出现则需要重新检测。

3 统计学处理 哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验研究组和对照组等位基因和基因型频率以及各SNP位点基因型和基因分布，HWE平衡检验采用Fisher精确检验，χ2=∑[（检测值-预期值）2/预期值]。基因及基因型频率采用群体遗传基因计数法计算：假设等位基因a和b的频率分别为p和q，纯合子aa的频率为p2，bb的频率为q2，杂合子的频率为2pq，其中p2+q2+2pq=1。利用CLUMP软件对SNPs基因型、等位基因及单倍型在研究组和对照组人群分布频率进行显著性检验；P＜0.05表示差异有统计学意义，且OR值处于95%置信区间内。

表1 合成HPA1-6及HPA17基因分型引物序列

结 果

1 HPA基因分型结果 ITP患者及正常人群HPA的PCR-SSP基因分型结果电泳图（两组各选1例），见图1。

2 HWE平衡检验 青岛市ITP患者及正常人群HPA基因多态性符合Hardy-Weinberg定律（P＞0.05）。见表2。

3 两组HPA1-6及HPA17基因型频率比较 ITP组患者与正常人HPA1-2、HPA4-6、HPA17基因型频率差异无统计学意义（P＞0.05）；两组HPA-3基因型频率差异有统计学意义（P＜0.05），与对照组比较，ITP组患者HPA-3 aa基因型频率显著降低（P＜0.05），HPA-3 bb基因型频率显著升高（P＜0.05）。见表3。

4 两组HPA1-6及HPA17基因频率比较 ITP组患者与正常人HPA1-2、HPA4-6、HPA17等位基因频率差异无统计学意义（P＞0.05）；两组HPA-3等位基因频率差异有统计学意义（P＜0.05）；ITP患者HPA-3a基因频率显著低于对照组（P＜0.05），HPA-3b基因频率显著高于对照组（P＜0.05）。见表4。

5 HPA1-6及HPA17基因多态性与ITP遗传易感性关系以发生ITP因变量，将HPA1-6、HP17基因多态性纳入Logistic回归分析，结果表明，HPA-3b与ITP遗传易感性有关（P＜0.05）。见表5。

讨 论

ITP是一种免疫综合征，以外周血血小板减少、自发性皮肤黏膜出血为主要症状，目前尚无治疗该疾病的速效药物，患者可能需要经历较长的治疗周期，且会出现病情复发及药物并发症。HPA是定位于血小板膜糖蛋白上的特异性抗原表位，是重要的遗传学标记[6，7]。大量报道证明其基因多态性与ITP发病相关，因此针对HPA基因多态性寻找ITP易感基因[8，9]，对于ITP疾病预测和及早介入治疗具有重要意义。

在已确定的34个HPA中，HPA1-5和HPA15为双等位基因表达。HPA基因多态性具有地域和种族异性，研究发现，HPA在ITP患者中较在正常人群表现出高度遗传多态性，基因型及等位基因频率分布与人群和地区分布有关。Refsum等[10，11]研究发现，亚洲人群中HPA-1基因主要为aa纯合子，其等位基因HPA-1b较为罕见，但在白种人中可检测到HPA1b/1b纯合子。在本研究中，未检测到HPA1b/1b纯合子，但检测到HPA-1a/1b杂合子，与车进等[12]研究结果一致。本研究对HPA1-6、HPA17系统等位基因概率分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，发现均符合Hardy-Weinberg定律，表明本研究选取的青岛市人群ITP患者及正常人群样本具有一定代表性。

表2 HWE平衡检验

表3 两组HPA1-6及HPA17基因型频率比较

表4 两组HPA1-6及HPA17基因频率比较

表5 HPA1-6及HPA17基因多态性与ITP遗传易感性关系

Carmo等[13]研究结果显示，巴西北部ITP患者中，HPA-5b等位基因频率较正常人显著升高，提示HPA-5b可能与当地人群血小板特异性抗原表位形成有关。孙学兰等[11]研究显示，河南省ITP患者HPA-3基因频率与正常人差异显著。本研究在ITP组患者与正常人中均未检测到HPA1-2、HPA4-6、HPA17基因bb纯合子，且基因型频率差异无统计学意义，而两组HPA-3具有高度遗传多态性，且与对照组比较，ITP组患者HPA-3 aa基因型频率显著降低，HPA-3 bb基因型频率显著升高，提示HPA-3 bb纯合子基因型突变可能与ITP发病有关。进一步统计分析发现，ITP组患者与正常人两组受试者HPA1-2、HPA4-6、HPA17等位基因频率差异无统计学意义，两组HPA-3基因频率差异有统计学意义，推测在青岛市人群中，HPA-3系统与ITP疾病发生有关，ITP患者HPA-3a基因频率显著低于对照组，HPA-3b基因频率显著高于对照组，携带HPA-3b等位基因可能是ITP发病的易感因素。Logistic回归分析结果表明，HPA-3b是ITP疾病发生的危险因素，进一步表明，HPA-3b等位基因可能是青岛市ITP患者的遗传易感基因。本研究中未发现HPA1-2、HPA4-6、HPA-17等位基因与ITP发病有关，与唐利娟等[14]研究结果一致，推测可能与地区特异性有关。在本研究中，虽然两组HPA-1、HPA-4、HPA-17基因型无显著差异，但在ITP患者中分别检测出2例HPA-1a/1b、2例HPA-4a/4b、1例HPA-5a/5b、1例HPA-17a/17b杂合子基因型，推测HPA-1b、HPA-4b、HPA-5b、HPA-17b可能与ITP患者发病有一定倾向性。

综上所述，HPA-3系统与ITP疾病发生有关，ITP患者HPA-3b基因频率显著高于对照组，可能是ITP发病的易感因素。本研究不足之处，本研究选取样本量较小，可能对研究结果造成一定偏倚，需要进一步扩大样本量深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突