不同食品基质中杂环胺的检测技术研究进展

李海霞，黄俊源，何昀桐，白卫东，曾晓房，董浩

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

杂环胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs）主要产生于高温及长时间烹调加工处理富含蛋白质食品（如肉制品等）的过程中[1-3]。20世纪70年代科学家首次发现杂环胺以来，目前已经在各类食品中分离和鉴定出超过30种（见表1）不同类型的杂环胺[4]。一般来说，按照化学结构和生成条件的不同，杂环胺可分为两大类：氨基咪唑氮杂芳烃类和氨基咔啉类[5-6]。氨基咪唑氮杂芳烃类一般包括喹啉类、喹喔啉类和吡啶类，主要产生于100℃～300℃之间，由游离氨基酸、肌酸和己糖等前体物经复杂的美拉德反应形成，由于这类杂环胺在家庭的烹饪条件下就会产生，因此备受人们关注；氨基咔啉类主要是蛋白质或氨基酸在超过300℃的高温条件下热解产生[7-8]。

表1 30种从食品中分离和鉴定出的杂环胺Table 1 30 HAAs isolated and identified from various foodstuffs

杂环胺是一类高度致突变和致癌物质，能引发包括猕猴和啮齿动物肝脏、乳腺、结肠、胃、前列腺、食道等多个器官产生肿瘤病变。国际癌症研究机构已将2-氨基-3-甲基咪唑并 [4，5-f]喹啉归类为可疑致癌物（2A 级别），而把 2-氨基-3，4-二甲基咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉等 7 种杂环胺等列为潜在致癌物（2B级别）[9-11]。经常食用含有杂环胺的食物会对人体健康产生一定的危害，因此，食品中杂环胺的分析检测和暴露评估显得尤为必要。

目前，杂环胺已经被报道在畜禽肉制品、鱼肉制品、焙烤制品、咖啡制品、乳制品、酒精饮料等多种类型食品中检出，涉及的检测方法主要包括高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、超高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等[12-24]。由于食品中通常含有大量的油脂、蛋白质、色素等不同类型的杂质，因此在杂环胺的仪器分析前，还需要对样品进行适当的前处理，常见的前处理手段主要包括溶剂萃取、固相萃取、分散固相萃取和固相微萃取等[25-27]。尽管这些前处理和检测技术的应用能够达到检测食品中杂环胺的目的，但由于食品中的杂环胺仅以痕量水平（μg/kg，ppb级别）存在，再加上检测过程中易受其他无法祛除杂质的干扰，因此，食品基质中杂环胺的提取净化和精准检测仍是本领域的研究难点[22-23]，高效、快速、高选择性和高灵敏度的分析检测方法对于杂环胺的分析和研究至关重要。基于此，本文以不同的食品基质为切入点，针对肉制品、鱼肉制品、咖啡制品、乳制品、焙烤制品、酒精饮料和其他食品，系统综述2010年～2019年各类食品中杂环胺的提取净化和检测方法，并对典型的分析方法进行比较，旨在为不同食品基质中杂环胺的分析检测和暴露评估提供较为系统的借鉴和参考。

1 肉制品中杂环胺的分析检测

肉制品属于高蛋白质食品，非常容易在烹调等热加工过程中产生杂环胺的污染，因此，肉制品中杂环胺的分析检测是国内外学者的研究热点，得到了最为广泛的报道。郭海涛等[28]对样品中的杂环胺进行液-液萃取、阳离子交换柱净化和富集后，建立同时测定羊肉制品中9种杂环胺的固相萃取-高效液相色谱（solid phase extraction-high performance liquid chromato-graphy,SPE-HPLC）分析方法，方法的检出限可达1.6 μg/L～41.0 μg/L，回收率为 50.27%～94.77%。Yan 等[14]建立一种简便、准确的乙腈萃取预处理结合超高效液相色谱串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatogra-phy tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）方法，可用于同时测定烤猪肉等肉制品中的17种杂环胺，方法的回收率为42.5%～99.0%，定量限可达0.028 μg/kg～0.648 μg/kg。Aeenehvand 等[16]建立微波辅助萃取-分散液-液微萃取-高效液相色谱法测定汉堡肉饼中3种极性杂环胺的分析方法，该方法的加标回收率可达90%～105%，检出限能够达到 0.06 μg/kg～0.21 μg/kg。同样地，Vichapong等[29]也利用建立的离子对表面活性剂辅助微波辅助萃取-分散液-液微萃取-高效液相色谱方法对烤猪肉样品中的4种杂环胺进行检测。Hsiao等[12]利用快速样品前处理技术（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe，QuEChERS）实现了肉制品中杂环胺的高效提取和净化，结合LC-MS/MS技术建立同时测定肉制品中20种杂环胺的分析方法，方法的回收率为58.9%～117.4%，定量限和检出限分别为0.003 μg/kg～0.05 μg/kg和 0.01 μg/kg～0.05 μg/kg。Vichapong 等[19]采用气体鼓动浊点萃取法集合HPLC技术，构建一种同时测定烟熏香肠中4种杂环胺的检测方法，方法的富集因子可达 80 以上，检出限为 1 μg/kg～3 μg/kg。Khan等[30]建立同时测定熟骆驼肉中5种致癌/致突变杂环胺的固相萃取-超高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测方法，可用于烧、烤、煎、炖等多种热加工处理下骆驼肉中杂环胺的含量检测。此外，国内外文献还报道了传统禽肉制品[31]、牛肉干制品[32]、肉丸[18,33]、鸡肉[34-35]、肉汤[36]、烧烤[37]等其他类型肉制品[38-42]中杂环胺的最新分析检测方法。

2 鱼肉制品中杂环胺的分析检测

鱼肉当中也含有丰富的蛋白质，再加上鱼类加工制品中基质复杂、杂环胺种类较多但含量较低，因此需要更加灵敏的检测设备和技术。徐琦等[43]建立同时测定鱼类加工品中12种杂环胺类的超高液相-质谱联用分析方法，样品经有机溶剂提取，MCX固相萃取小柱净化，梯度洗脱，电喷雾离子源正离子模式下检测，内标法定量，结果发现方法的平均回收率为42.98%～125.00%，相对标准偏差为1.49%～9.88%，方法检测限可达 0.3 μg/kg～1.0 μg/kg。Oz 等[44]采用 SPE-HPLC方法，研究微波、平底锅、烤炉、热板、烧烤等不同烹调方法和脂肪水平（瘦肉和脂肪）对各种鱼类（三文鱼、鲭鱼、沙丁鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲈鱼）杂环胺形成的影响，结果发现，该方法能够快速、准确的检测鱼肉制品中9种杂环胺的含量，烧烤是最容易产生杂环胺和杂环胺产生量最高的一种热加工方式。Wang等[45]同样采用SPEHPLC方法，研究不同的煎炸条件对草鱼中杂环胺生成的影响，结果发现随着煎炸次数的增加，杂环胺的种类不断增加，煎炸25次后共检测到7种类型的杂环胺。张峰等[15]对烤鱼中的杂环胺进行分析，样品经甲醇-1.0 mol/L NaOH溶液超声辅助提取后，Lichrolut EN固相萃取柱净化，然后经超高液相-质谱联用分离和检测，内标法定量，结果表明，15种杂环胺的定量限为1.0 g/kg，回收率多在79.0%～118.8%之间，相对标准偏差多在1.3%～10.0%之间。肖维等[46]采用MCX固相萃取小柱对鱼制品中的8种杂环胺进行了净化和富集，结合HPLC技术建立同时测定鱼制品中8种杂环胺的方法，结果表明，该方法的线性关系良好，检出限为0.3 μg/kg～3.8 μg/kg，以空白样品为基体进行加标回收试验，所得回收率为51.8%～93.7%，相对标准偏差在0.89%～3.7%之间。这些方法的建立可为杂环胺在鱼肉制品中的消除规律以及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段。

3 咖啡制品中杂环胺的分析检测

咖啡制品，如速溶咖啡和咖啡粉，一般经过高温蒸馏、喷雾干燥、烘焙等热加工工序制作而成，因此，咖啡制品中也存在杂环胺污染的可能。随着消费者对咖啡需求的不断增加，咖啡及其制品中杂环胺的分析检测尤为必要。Karpaviiūtc.等[17]建立同时测定炒咖啡中氨基二吡啶并[1，2-a:3′，2-d]咪唑盐酸盐、2- 氨基 -6-甲基二吡啶并 [1，2-a:3′，2′-d]咪唑、2-氨基-5-苯基吡啶、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚5种杂环胺的固相萃取-高效液相色谱仪-荧光检测器检测方法，样品经乙酸乙酯提取后，Bond Elut PRS固相萃取柱净化，最后经高效液相色谱检测，结果表明：方法的检出限和定量限分别为 0.21 μg/kg～0.51 μg/kg 和 0.38 μg/kg～0.93 μg/kg，方法的加标回收率为40%～56%，实际样品分析发现，有1个样品检测出2-氨基-1，6-二甲基咪唑并[4，5-6]吡啶。Xian等[47]基于QuEChERS分散净化、Fe3O4纳米粒子脱色以及超高效液相色谱-串联质谱技术，建立一种同时测定咖啡中丙烯酰胺和杂环胺等15种有害胺类代谢物的分析方法，结果表明，15种待测物在0.2 μg/L～100 μg/L范围内线性关系良好；方法定量限为1.0 μg/kg ～6.5 μg/kg；8 种待测物的基质效应可以忽略，7种待测物存在基质抑制；3个添加水平的回收试验，日内平均回收率为81.6%～100%，日内精密度在4.3%～9.0%之间；日间平均回收率为81.0%～101%，日间精密度为5.0%～7.8%；实际样品检测发现在咖啡和速溶咖啡样品中均检出1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚和9H-吡啶并[3，4-b]吲哚两种杂环胺，其中9H-吡啶并[3，4-b]吲哚含量较高，在 186.3 μg/kg～976.0 μg/kg之间。从上述文献的检测结果可以看出，咖啡粉和速溶咖啡中除了普遍含有备受关注的丙烯酰胺外，还普遍含有 1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚等杂环胺，因此，除了高效、灵敏、准确的检测方法构建，还应加强其风险水平和暴露水平的关注。

4 酒精饮料中杂环胺的分析检测

目前国内外对酒精饮料中杂环胺的分析检测研究较少，然而，Herraiz[48]曾经报道过，发酵酒中主要是1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚和 9H-吡啶并[3，4-b]吲哚杂环胺的污染，含量为 0～41 μg/L。Richling 等[49]也曾经采用建立的高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法分析市场上葡萄酒中杂环胺的含量，结果发现，25个葡萄酒样品中，有24个检测出杂环胺的污染，含量较高的主要包括2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并 [4，5-b]-吡啶、2-氨基二吡啶并[1，2-a:3′，2-d]咪唑盐酸盐、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚，含量水平在 8 ng/L ～107 ng/L。由此可见，酒精饮料中杂环胺的检测和含量评估也尤为重要。近年来，王敏等[50]建立液相色谱-离子阱-飞行时间串联质谱法同时测定葡萄酒中14种杂环胺含量的分析方法，样品经Phenomenex strata-X-C阳离子交换固相萃取小柱提取净化，内标法定量，结果发现该方法的检出限为 0.33 μg/L～1.77 μg/L，加标回收率能够达到71.6%～103.3%，精密度和准确度较高，分析时间短，净化效果好，可满足葡萄酒中多种杂环胺残留同时检测的要求。可以看出，关于酒精饮料中杂环胺的分析检测方法还不全面，建立的检测方法主要集中在葡萄酒等，对于白酒、黄酒等中国传统酿造酒以及世界消费量最大的啤酒中杂环胺的分析和检测还鲜有报道，因此，仍需加强酒精饮料中杂环胺的分析检测和暴露评估研究。

5 焙烤食品中杂环胺的分析检测

焙烤食品是以小麦等谷物粉料为基本原料，通过发酵、高温焙烤过程而熟化的一类食品。在高温焙烤过程中，这类食品中的还原糖和氨基酸或蛋白质发生美拉德及焦糖化等反应，产生一系列风味物质，但同时也可能产生一些有害副产物，杂环胺就是其中的一类。欧阳运富等[51]建立一种加速溶剂萃取-液相色谱-离子阱飞行时间质谱方法，并应用于油炸土豆条等烹调食品中3种常见杂环胺含量的检测，样品首先经乙腈提取，氮吹至干，残留物定容后经C18色谱柱分离，甲酸溶液和乙腈作为流动相梯度洗脱，正离子模式监测，结果表明：3种杂环胺的检出限在0.3μg/kg～0.9 μg/kg之间，加标回收率可达79.5%～105%，相对标准偏差在2.1%～6.9%之间，油炸土豆条中检测出2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉的污染（2.6μg/kg）。Wu等[52]建立焙烤食品（面包、月饼、蛋糕和饼干）中14种杂环胺类化合物（1-甲基-9H-吡啶并 [3，4-b]吲哚、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]吡啶、2-氨基-1，6-二甲基咪唑并[4，5-b]吡啶、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚、2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉、2-氨基-3，7，8-三甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉和 2-氨基-3，4，7，8-四甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉）的分散固相萃取净化-超高效液相色谱串联质谱检测方法，样品经乙腈-1 mmol/L氢氧化钠溶液超声萃取，N-丙基乙二胺净化，在C18色谱柱上以乙腈和1 mmol/L乙酸铵（含0.04%乙酸）为流动相梯度洗脱，采用电喷雾离子源、正离子多反应监测模式检测，外标法定量，结果表明，14种待测物在相应的浓度范围内线性良好，相关系数均大于 0.999；方法定量限为 0.3 μg/kg ～4.5 μg/kg；进行3个水平的添加回收试验，平均回收率为62.8%～96.8%；相对标准偏差为1.2%～7.6%；应用本方法检测20个焙烤食品样品，检出4种杂环胺类化合物1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]-吡啶。

6 其他食品中杂环胺的分析检测

除了肉制品和以上所述食品，其他食品中杂环胺的检测方法和暴露量水平研究也有一定的报道。例如，Gonzalo-Lumbreras等[39]建立一种毛细管液相色谱-质谱联用技术方法，并应用于软奶酪等食品中4种杂环胺（2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉,9H-吡啶并[3，4-b]吲哚，1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚）的检测，结果发现，4种杂环胺的检出限最低可达0.004 μg/L～0.023 μg/L，4种不同浓度的加标回收率均在85%以上，因此，本方法灵敏准确，适用于软奶酪等食品中杂环胺的分析检测。Naccari等[53]也分析了来自于意大利卡拉布里亚的烟熏“普罗沃拉”奶酪中的杂环胺，结果得出不同烟熏工艺以及不同部位的奶酪均有杂环胺的污染，而且含量差异显著。Chang等[23]采用分散固相萃取与HPLC-MS/MS联用，建立同时测定未精制和精制烹调油脂中20种杂环胺的方法，并应用于48种油脂样品的检测，结果发现猪油、椰子油、植物油、其他固体油脂等油脂中均检出不同种类和含量的杂环胺。Canales等[54]建立一种基于悬浮有机液滴固化，超声辅助反萃的新型分散液-液微萃取方法，并结合UHPLCMS/MS技术对自来水中的4种杂环胺进行了测定，该方法在 2.2 μg/L～50 μg/L之间线性关系良好，方法的检出限为0.7μg/L～2.9 μg/L，加标回收率可达92%～106%，相对标准偏差在4.3%～6.7%之间，方法准确可靠，适用于自来水以及环境水样中杂环胺的分析检测。Basheer等[55]同样建立一种检测海水中杂环胺的方法，主要采用微固相萃取和HPLC技术，该方法的检出限更低，可达0.004μg/L～0.026 μg/L，重现性在1.3%～7.5%之间，加标回收率为79.9%～95.2%，实际样品中检测出 1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚（0.07 μg/L）和 2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]-吡啶（0.13 μg/L）的污染。除此之外，牛乳、豆饼、醋、番茄酱、酱油、可可豆等食品中也被报道过杂环胺的污染[3,56]。不同食品基质中杂环胺类化合物的典型检测方法及其性能参数比较见表2。

表2 不同食品基质中杂环胺的典型检测方法及性能参数Table 2 Typical analytical methods for determination of HAAs in various food matrices and their performances

续表2 不同食品基质中杂环胺的典型检测方法及性能参数Continue table 2 Typical analytical methods for determination of HAAs in various food matrices and their performances

7 总结与展望

杂环胺是在富含蛋白质的食品加热过程中自然形成的，它们的形成高度依赖于烹饪方法、水分含量、pH值和肌酐含量、食物种类等多种因素。目前，一些杂环胺的形成机制，如2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉型杂环胺、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]-吡啶、1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚等已被阐明并被科学家广泛接受。食品中杂环胺的提取净化和分析检测近年来也得到了广泛报道，虽然使用液液萃取、固相萃取等前处理手段结合液相色谱法、超高液相色谱法、质谱法等现代分析技术对不同食品中的杂环胺进行检测，但由于杂环胺在食品中的痕量存在以及食品基质的高度复杂性，未来一段时间内，杂环胺的精准分析和测定仍然是一项艰难的任务。这一难题只能通过精细化提取、高效纯化和预浓缩步骤（如采用QuEChERS、分散固相萃取技术）相结合，然后采用串联质谱法等高灵敏的检测手段定量其痕量水平来解决。此外，还需要进一步的研究来寻找更快速的技术，从而更有效地识别这些污染物。除此之外，还需加强酒精饮料、焙烤食品等除肉制品以外的食品中杂环胺的分析检测和暴露评估研究。