芹菜汁发酵条件优化及替代亚硝酸盐对调理猪肉饼品质的影响

王吉，武佳文，张昊，朱迎春

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中030801）

亚硝酸盐是腌肉制品加工过程中普遍使用的一种食品添加剂，它在加工过程中起着发色、抑制肉毒梭状芽孢杆菌生长、抗氧化和呈现特殊风味的作用[1-2]，而且也是目前已知的唯一一种在腌肉制品中能同时起到以上4种作用的物质。但是在烹调或其他条件下，肉制品中的亚硝酸盐可与氨基酸发生降解反应，生成具有强致癌性的亚硝胺[3]。

美国农业部规定[4]，凡是标有“有机”和“天然”标签的肉制品，不允许含有人工合成型化学物质或者添加剂，比如亚硝酸盐、异抗坏血酸钠等。因此，研究人员寻求化学合成型亚硝酸盐的天然代替物，“天然腌制”的概念被学者提出：利用某些微生物使得硝酸盐含量高的蔬菜中的硝酸盐转化为亚硝酸盐，制成蔬菜汁（粉），添加到肉制品中。Yilmaz等应用番茄汁在低脂熟制香肠中[5]，Candogan等应用番茄酱在牛肉饼中[6]，Krause等[7]应用发酵芹菜粉于灌肠中均取得较好效果。Riel等[8]把香芹汁粉加入意大利香肠中，对微生物、理化及感官品质加以考察，认为香芹粉可以替代人工合成型亚硝酸盐。

目前，应用在发酵肉制品领域的商业复合菌种种类较多，部分菌种具有硝酸盐还原能力，但是如何利用商业型复合菌种生产天然腌制肉，目前报道较少。本文首先以3种复合菌种为发酵剂发酵芹菜汁，筛选将芹菜中富含的硝酸盐转化为亚硝酸盐的最佳发酵条件，然后将最优条件下发酵的芹菜汁添加到调理猪肉饼中，研究发酵芹菜汁（fermented celery juice，FCJ）对调理猪肉饼品质特性的影响，探究天然亚硝酸盐取代人工合成亚硝酸盐的可能性，为实际生产和应用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪肉：山西农业大学双汇冷鲜肉专卖店；新鲜芹菜、香辛料、白糖：山西农业大学农贸市场；食盐、花椒、醋、料酒、白糖、胡椒粉、五香粉、香油、鸡精、生姜粉、玉米淀粉等均为食品级：山西农业大学寸草心超市。

硼砂、亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、冰乙酸、氧化镁、硼酸、三氯乙酸、丁基羟基茴香醚、乙二胺四乙酸、2-硫代巴比妥酸、氯仿、复合磷酸盐、氢氧化钠、抗坏血酸钠（均为分析纯）：天津化学试剂一厂。

1.2 主要仪器与设备

SHZ-B水浴恒温振荡器：上海跃进医疗器械厂；FA2004电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-S8电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；WFJT200紫外/可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；JS39D-250榨汁机：浙江苏泊尔股份有限公司；PHB-4型pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；3K15型高速冷冻离心机：德国Sigma公司；CR-400型色差仪：日本Minolta公司；HY-2调速多用振荡器、79-1型磁悬浮搅拌器：常州国华电器有限公司；FA25高剪切分散乳化机：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；600型真空包装机：晋中佳通机电科技有限公司；JD31A847A电饼铛：苏泊尔股份有限公司。

1.3 供试发酵剂

发酵剂购自意大利丹尼斯克公司，每袋20 g，总菌数为1.0×1012CFU，均为复合菌种。lyocarni SBM-52型发酵剂由木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌组成；lyocarni SHI-59型发酵剂由木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳酸菌组成；lyocarni VBM-60型发酵剂由木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌组成。

1.4 试验方法

1.4.1 芹菜汁的制作与发酵

芹菜汁的制作：将购买的新鲜芹菜清洗、沥水、切碎、加入同质量的水榨汁过滤后得到芹菜汁。

芹菜汁的发酵：准备若干洁净的500 mL锥形瓶，每个锥形瓶中加入芹菜汁、发酵剂、葡萄糖，调节pH值，恒温发酵，且每隔2 h调一次pH值，分别在0、12、24、36、48、60 h 测定亚硝酸盐含量。

1.4.2 调理猪肉饼制作

调理猪肉饼的基本配方：以绞碎猪肉500 g计（肥瘦比为2∶8），食盐 8 g、玉米淀粉 68 g、复合磷酸盐2 g、白糖 5 g、醋 20 g、抗坏血酸钠 0.5 g、料酒 20 g，充分搅拌均匀。将肉馅用模具制成肉饼，每个质量为（50±5）g。每个肉饼均用尼龙/聚乙烯袋[23℃时，透氧性90 mL/（m2·24 h）]真空包装，之后贮藏于冰温条件（-1.5±0.5）℃。每隔6 d进行品质分析，直到出现表面发黏、色泽灰暗、气味异常时为止。

1.5 试验设计

试验分为两部分。第一部分通过单因素试验筛选能将芹菜中硝酸盐最大程度转化为亚硝酸盐的发酵条件。试验分别设计为发酵剂种类lyocarni SBM-52、lyocarni SHI-59、lyocarni VBM-60；发酵温度 25、30、35、40 ℃，发酵剂添加量 3.125×104、6.25×104、1.25×105、2.5×105、5.0×105CFU/mL 和 pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 为单因素水平。

第二部分研究发酵芹菜汁替代亚硝酸盐对调理猪肉饼品质特性的影响。调理猪肉饼的分组情况为：空白对照（control check，CK）组：既不添加亚硝酸钠，也不添加发酵芹菜汁；亚硝酸钠对照（nitrite，NT）组：添加150 mg/kg的亚硝酸钠；FCJ组：添加芹菜汁。经测定发酵芹菜汁中亚硝酸盐含量为1 357.45 mg/kg，按照生产要求亚硝酸钠最大添加量不超过150 mg/kg计算，调理猪肉饼制作时加入发酵芹菜汁的量为110.5 g/kg（对照加以同等质量的无菌水）。

1.6 指标测定方法

1.6.1 亚硝酸盐测定方法

采用GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中分光光度法测定。

1.6.2 脂肪氧化程度测定

硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的测定参考 LizaJohn 等[9]的方法。

1.6.3 挥发性盐基氮的测定

参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》的方法进行测定。

1.6.4 pH值的测定

参照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》的方法进行测定。

1.6.5 色差值的测定

制备均匀样品，平铺在色差平皿底部，将色差仪进行白板校正后检测其亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*）值。

1.6.6 生物胺的测定

生物胺的测定参照党晓燕等[10]的方法进行。

1.6.7 感官评价

感官评定的方法：将猪肉饼置于电饼铛中烤制至中心温度达到75℃，立即请10名专业人员组成的感官评定小组进行感官评分。评价标准包括肉饼的色泽、质构、多汁性、酸败味、整体接受性5项，每项指标分值为1分～10分。对于色泽，1=灰暗，10=鲜亮；对于质构，1=粗糙，10=光滑；对于多汁性，1=干燥，10=多汁；对于酸败，1=严重的刺激气味，10=感觉不到；对于整体接受性，1=低，10=高，总分50分。

1.7 数据处理

试验均设3次重复，结果用平均值±标准差表示，采用Microsoft Excel 2007软件对试验数据进行统计分析，Sigma plot 10.0绘图软件绘图，并应用statistics 8.1中Turkey HSD程序进行显著性差异分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 芹菜汁发酵条件的优化

不同发酵条件对芹菜汁中亚硝酸盐含量的影响见图1。

图1 不同发酵条件对芹菜汁中亚硝酸盐含量的影响Fig.1 Effect of different fermentation conditions on the content of nitrite in celery juice

由图1A可知，发酵0～12 h，4组芹菜汁中亚硝酸盐含量均快速增加，达到高于500 mg/kg的水平，并在发酵中后期（24 h～60 h）维持该水平不变（P＞0.05）。4组FCJ比较，发现接种发酵剂lyocarni VBM-60转化亚硝酸盐的能力最强，发酵12 h该组亚硝酸盐含量达到峰值，为754.98 mg/kg，并在后续的发酵过程中亚硝酸盐含量维持在700 mg/kg之上，显著高于其他组（P＜0.05）。lyocarni VBM-60发酵剂由木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌组成，研究显示，肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌应用到发酵肉制品中，除了有利于干发酵香肠成熟过程中风味物质的形成和脂质氧化程度的控制外，作为非乳酸菌发酵剂，含有较强的硝酸盐还原酶活性，能够将硝酸盐转化成亚硝酸盐[11]。lyocarni VBM-60发酵剂效果最好，这可能是因为和其他两种发酵剂比较，lyocarni VBM-60发酵剂中硝酸盐还原菌所占比例更高的缘故。

由图1B可知，发酵温度是影响芹菜汁中亚硝酸盐含量的一个重要因素。在发酵过程中，虽然4组芹菜汁中亚硝酸盐含量都呈现先显著增加后略有降低的趋势，但是发酵温度不同，亚硝酸盐含量达到峰值的高低和出现的时间点不同，35℃和40℃发酵的峰值出现在第12小时，而25℃和30℃的峰值在第24小时出现，即发酵温度高，峰值出现时间早，但亚硝酸盐转化率降低，特别是发酵温度为40℃时，较高的温度抑制了发酵菌株的活力，所以亚硝酸盐转化率也较低。当发酵温度为30℃时，芹菜汁中亚硝酸盐的含量可高达 712.06 mg/kg（24 h），显著高于其他 3 组（P＜0.05）。

由图1C可知，不添加发酵剂的对照组，依靠芹菜中自身的微生物，硝酸盐也可转变为亚硝酸盐，但是发酵剂的添加明显促进了亚硝酸盐的转化。发酵剂添加量为3.125×104CFU/mL时，亚硝酸盐转化率最高，其含量达到1 055.76 mg/kg（24 h）。随着添加量的增加，亚硝酸盐含量并没有升高反而有所降低，这表明3.125×104CFU/mL的添加量是最合适的。

由图1D可知，发酵pH值显著影响芹菜汁中亚硝酸盐的生成量。pH 4.5～5.0的发酵环境使发酵菌株产生的亚硝酸盐还原酶的活力较弱，且生成的亚硝酸盐还有可能发生酸降解，导致亚硝酸盐含量减少[12]。发酵过程不调节pH值的FCJ亚硝酸盐含量波动较大且在发酵后期显著降低（P＜0.05）。调节pH值并在发酵过程中维持恒定有利于亚硝酸盐的转化。发酵过程中pH恒定维持为6.0时，芹菜汁亚硝酸盐生成量最高，达到1 357.45 mg/kg（48 h）。

通过上述试验得出芹菜汁最佳发酵条件为接种VBM-60型发酵剂，发酵温度30℃，发酵剂添加量3.125×104CFU/mL，发酵 pH 值维持恒定 6.0，发酵48 h，芹菜汁中的亚硝酸盐含量升到最高值，为1 357.45 mg/kg。

2.2 发酵芹菜汁对调理猪肉饼品质的影响

2.2.1 发酵芹菜汁对调理猪肉饼感官品质的影响

肉制品在贮藏过程中的可接受性依赖于它的感官变化，随着贮藏时间的延长，在自身内源酶及外来微生物的作用下，蛋白质、氨基酸和其他含氮物质会被分解成为氨、三甲胺、硫化氢及吲哚等低级产物，产生具有腐败特征的臭味而失去食用价值[13]。发酵芹菜汁对调理猪肉饼感官品质的影响如图2所示。

贮藏前期（0～12 d），3组调理肉饼均很好地保持了其新鲜的品质（感官评分>40分，总分为50分），而且不同处理组之间没有显著性差异（P>0.05）。随着贮藏时间的延长，调理肉饼新鲜度明显下降。贮藏24 d时，CK组色泽暗，咀嚼性差，有轻微的腥臭味出现，不再适于食用而进入到腐败阶段（感官评分＜30分）。而NT组和FCJ组在冰温贮藏24 d时仍维持在可食用范围之内。NT组与FCJ组比较，咀嚼性、汁液、香味都无明显差异，但从色泽来看，FCJ组因为添加了芹菜汁，色泽相对较暗。通过感官评定可知CK组、NT组和FCJ组调理肉饼分别在18、30 d和24 d达到感官可接受期限的极限点。

图2 发酵芹菜汁对调理猪肉饼中亚硝酸盐残留量的影响Fig.2 Effect of fermented celery juice on sensory quality in readyto-eating pork patty

2.2.2 发酵芹菜汁对调理猪肉饼中亚硝酸盐残留量的影响

图3为发酵芹菜汁对调理猪肉饼中亚硝酸盐残留量的影响。

图3 发酵芹菜汁对调理猪肉饼中亚硝酸盐残留量的影响Fig.3 Effect of fermented celery juice on nitrite residue in readyto-eating pork patty

由图3可知，在贮藏期间，3组亚硝酸盐残留量在第6天之前明显降低（P＜0.05），之后基本维持稳定。3组进行比较，不添加亚硝酸盐的CK组由于自身微生物的分解作用，肉饼中残留1.34 mg/kg～5.49 mg/kg的亚硝酸盐，而NT组和FCJ组的亚硝酸盐残留量则在前期显著下降的基础上维持在10.08 mg/kg～12.75 mg/kg和7.71 mg/kg～8.86 mg/kg的水平，且FCJ组的亚硝酸盐残留水平始终低于CK组。相关文献对添加韭葱粉发酵香肠[14]、芹菜粉乳化香肠[15]亚硝酸盐残留量进行了研究，均显示其中亚硝酸盐残留量要低于添加化学型亚硝酸盐的香肠，并且最终保持平衡，与本试验研究结果类似。上述结果也表明使用富含硝酸盐的蔬菜汁代替无机亚硝酸盐的添加会赋予产品更高的安全性。

2.2.3 发酵芹菜汁对调理猪肉饼中TBARS值的影响

TBARS值反映脂质过氧化程度，涵盖了大部分氧化反应产生的醛酮类物质，因而常作为判定脂质过氧化程度的指标[16]。图4为发酵芹菜汁对调理猪肉饼TBARS值的影响。

图4 发酵芹菜汁对调理猪肉饼中TBARS值的影响Fig.4 Effect of fermented celery juice on TBARS value in readyto-eating pork patty

由图4可知，TBARS值随着贮藏时间的延长呈显著上升趋势（P＜0.05）。其中，CK组TBARS值显著高于其他两组（P＜0.05）。第24天时，CK组TBARS值为0.62 mg/kg，而NT组和FCJ组分别为0.41 mg/kg和0.48 mg/kg且差异不显著（P>0.05），显示出较好的抗氧化活性。李沛然等[17]考察发酵芹菜粉在灌肠中的应用效果，发现试验组灌肠的TBARS值低于对照组。孙冬梅等也研究了芹菜中黄酮类物质的抗氧化活性，并将芹菜粉应用到肉制品中，发现芹菜粉是一种有效的自由基清除剂，可降低肉制品的TBARS值[18]。但在后期的贮藏过程中，NT组的抗氧化性高于FCJ组（P＜0.05），说明发酵芹菜汁的抗氧化能力与化学型亚硝酸盐有一定差距。

2.2.4 调理猪肉饼冰温贮藏期间生物胺的变化

表1为发酵芹菜汁对调理猪肉饼中生物胺含量的影响。

生物胺广泛存在于富含蛋白质和氨基酸的食品中[19]，过量摄入会导致人体中毒，造成血管膨胀，导致血压波动和头痛、肠部痉挛、腹泻和呕吐等[20]，已被欧美国家建议列入肉制品的安全限量摄入[21]。在冰温贮藏过程中，CK组、FCJ组和NT组的尸胺、精胺均未检出，NT组亚精胺未检出。3组调理猪肉饼色胺呈显著上升趋势（P＜0.05），贮藏36 d时CK组色胺含量显著高于其他两组（P＜0.05）。3组调理猪肉饼中苯乙胺含量变化趋势大致相同：呈上下波动的趋势，但是贮藏后期含量均显著高于贮藏前期（P＜0.05）；腐胺有较强生理毒性，会引起人体痉挛、血压降低[22]，腐胺存在于所有检测样品的所有检测点中，成为主要的生物胺之一，NT组和FCJ组腐胺在贮藏过程中变化不明显，CK组贮藏后期有明显升高的趋势（P＜0.05）；组胺是生物胺中毒性最强的一类，除CK组贮藏末期组胺含量急剧升高外，其他两组产品组胺含量变化不显著（P＞0.05）；酪胺会引起偏头痛[23]，3组酪胺含量在贮藏后期均高于贮藏前期，特别是CK组，贮藏36 d时的含量是0 d的5.85倍；亚精胺只在FCJ组和CK组检测出来，含量均呈上升趋势，CK组在36 d达到峰值3.72mg/kg。从整个贮藏过程中生物胺的变化情况看，色胺、苯乙胺、酪胺和亚精胺含量的增加与贮藏时间相关，从质量的百分比来看，色胺、苯乙胺、腐胺和酪胺的变化在生物胺的变化中起着主导作用成为主要的生物胺。3组之间进行比较，贮藏过程中FCJ组和NT组色胺、组胺和酪胺的生成量差异不显著（P>0.05），FCJ组组胺含量和酪胺含量低于NK组，这可能是发酵剂中所含有的微生物具有降解生物胺的作用，已报道的生物胺降解菌有干酪乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、弯曲乳杆菌、肉葡萄球菌等[24-25]，到底发酵剂中哪一种菌株降解生物胺的能力更强，还有待进一步研究。

表1 调理猪肉饼贮藏期间生物胺的变化Table 1 Changes of biogenic amine value during storage of ready-to-eating pork patty

就生物胺总量而言，总体均呈显著上升趋势。CK组生物胺总量高于其他两组，说明无论是化学试剂型还是天然合成型亚硝酸盐，都对生物胺的形成起到抑制作用。

2.2.5 调理猪肉饼冰温贮藏期间色差的变化

表2为调理肉饼贮藏期间色泽的变化，L*值表示亮度，a*值表示红度，b*值为黄度。

贮藏过程中NT组L*值呈现先上升后下降趋势，FCJ组和CK组均呈下降趋势。贮藏后期，3组调理猪肉饼汁液流失加大，L*值降低。3组比较，贮藏前期和中期FCJ组的L*值最高，这可能是调理猪肉饼中添加发酵芹菜汁增强了光线反射的缘故。贮藏后期，3组调理猪肉饼中a*值都呈现降低趋势，这是由于红色的氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，MbO2）被氧化为褐色的高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MetMb）的缘故。虽然真空包装能在一定程度上阻隔氧气，但在贮藏过程中氧气仍旧会慢慢渗入，加速MbO2的氧化进程。3组比较，FCJ组的a*值最小，这是芹菜汁本身的绿色所致。3组调理猪肉饼的b*值都呈下降趋势，但是3组比较，差异并不显著（P＞0.05）。

表2 调理猪肉饼贮藏期间色泽的变化Table 2 Changes of color parameter during storage of ready-to-eating pork patty

3 结论

本试验确定芹菜汁最佳的发酵条件为接种lyocarni VBM-60型发酵剂，发酵温度30℃，发酵剂添加量为3.125×104CFU/mL，发酵pH值为6.0且维持恒定的条件下，发酵48 h亚硝酸盐含量可达到1 357.45 mg/kg。将利用最佳条件发酵获得的芹菜汁添加到调理猪肉饼中，并与阳性对照组（添加亚硝酸钠）和阴性对照组（既不添加发酵芹菜汁也不添加亚硝酸钠）的调理猪肉饼进行比较，发现芹菜汁添加组在亚硝酸盐残留量方面表现出了其优越性，并在抗氧化、抑制生物胺生成和感官品质方面可以部分替代化学合成亚硝酸盐。这为今后替代化学合成型亚硝酸盐生产绿色腌肉制品研究提供了科学依据。