多层纸基微流控芯片的设计及其对农药的可视化检测

杨 铖,毛罕平,李立治,张凯旋

(江苏大学 现代农业装备与技术教育部重点实验室,江苏 镇江 212013)

0 引言

由于农药的过度使用,农药残留超标严重,给环境和人类健康带来威胁。因此,对农药进行有效的检测是非常必要的。传统的农药检测方法有光谱法[1]和色谱法[2]等,但非常耗时,且需要的化学品价格昂贵,并要求操作人员技术熟练,不适合实时分析。近年来,微流控芯片以其样本量需求少、检测试剂消耗少、污染小、集成小型化与自动化及高通量等特点,在医疗、农业、环境等领域有着广泛的应用前景[3]。

相比玻璃、石英、PDMS等材料的微流控芯片,以纸为材料的微流控芯片因其成本低廉、制作简单、不需外力驱动微流体,更符合快速、简便、低成本、现场检测的要求[4]。Clémence等[5]利用喷蜡打印的方式制成二维纸芯片用来检测水中的有机磷酸酯。X Tian等[6]基于碳量子点(CDs)的高灵敏度和选择性的纸传感器,检测地下水中的TNT(2,4,6-三硝基甲苯炸药)残留。此方法为开发高灵敏度、选择性、便捷性和可视化农残检测器提供了一种有效的手段,但关于三维纸基微流控芯片混合特性的研究却很少。

为此,设计了阵列式多层纸基微流控芯片,对混合区的结构进行了优化仿真和试验研究,以提高混合效率,进而提高农药的可视化检测精度。

1 基于荧光内滤效应的可视化检测原理

荧光内滤效应(Inner Filter Effect,IFE),指当荧光体与吸光物质共存时,由于吸光物质对于激发光或发射光的吸收而导致荧光减弱的现象。其结合荧光探针耦合适配体的特异性,可实现对农药的可视化检测,原理如图1所示。

图1 基于荧光内滤效应的适配体农药残留检测原理Fig.1 Principle of detection of aptamer pesticide residues based on fluorescence internal rate effect

由于金纳米颗粒(AuNPs)的聚集状态对其光学性质具有一定的影响,在氯化钠溶液(NaCl)中,AuNPs的表面电荷很容易被NaCl屏蔽,从而导致颗粒间的团聚,AuNPs的吸光度会降低且吸收峰会红移,荧光探针(CdTe QDs)与AuNPs之间荧光内滤效应会被削弱,CdTe QDs的荧光颜色得到恢复。当加入农药核酸适配体后,适配体与AuNPs之间的配位作用吸附在其表面,AuNPs增加了抗盐析能力而分散,荧光内滤效应增强,CdTe QDs荧光颜色变暗;当加入目标农药分子时,适配体会与目标农药分子特异性结合,适配体从AuNPs上脱落,AuNPs再次被NaCl诱导发生团聚,由于荧光内滤效应而降低的荧光探针的荧光颜色再次恢复。因此,荧光内滤效应的强弱取决于目标农药分子的浓度,荧光探针的荧光强弱与目标农药浓度相关,据此可以实现对农药残留荧光可视化检测。

2 多层纸基微流控芯片的设计

2.1 多层纸芯片整体设计

为了满足快速、便捷的检测多种农药的要求,设计了折叠式多层纸基微流控芯片[7],并采用喷蜡打印的方法制作三维纸芯片[8],通过喷蜡打印机将需要的图案打印在滤纸表面,加热使打印在纸上的蜡因高温而融化,向下渗透到纸的纤维结构中从而形成疏水通道。

图2(a)是利用AutoCAD设计出来的九宫格纸通道平面图。图2(a)中：边长为6cm正方形由3×3个边长为2cm的小正方形组成,小正方形的大小即折叠后每层的大小;黑色区域是渗入蜡的疏水区域,白色区域是半径R为1.5mm的通道,右上角的序号表示折叠后每层的位置。图2(b)是九宫格式纸的折叠示意图,将图2(a)的平面按照图2(b)的顺序折叠,即可得到一个每层边长为2cm正方形的九层折叠纸芯片,厚度约为1.62mm(每层纸张的厚度约为0.18mm)。

图2 纸芯片设计以及进样示意图Fig.2 Design of paper chip and folding sequence

如图2(c)所示,此三维纸芯片由3部分组成：第1层为进样区,i1、i2分别表示农药的入口和NaCl溶液的入口;2～8层为混合运输区,其作用是为了保证样品得到充分混合并将其运输到反应区域;第9层为反应显色区。为了满足农残可视化检测的要求,根据荧光法农残检测的原理,分别设置了啶虫脒和丙溴磷两种农药的两个检测区,还设置了不施加农药的两个空白对照区。第1层i1、i2分别表示农药的入口和NaCl溶液的入口,第9层a1、a2分别是啶虫脒的检测区及对照区,纸上固定有啶虫脒的适配体- CdTe QDs - AuNPs体系;b1、b2分别是丙溴磷的检测区及对照区,纸上固定有丙溴磷的适配体 - CdTe QDs - AuNPs体系。农药和NaCl溶液分别从i1、i2口滴入,经过通道Ⅰ混合,在第8层被分配到a1、b1两个检测区,同时NaCl溶液也会通过通道Ⅱ最终流到a2、b2两个对照区。

纸张中的流体输送是一个被动的过程,通过纸张的毛细作用实现。三维纸芯片通过折叠使得多个流层实现液体的层层渗透,除了每层纸内的流动,还可以在两层之间垂直流动。这种方法可以使流体能够在一个紧凑的区域内被输送到大量反应场所。

2.2 混合通道的结构设计

农药残留检测过程中,多种试剂需要混合均匀以保证化学反应顺利进行。在纸基微通道中,试剂混合不均会大大影响检测的精确性和可靠性。为了在紧凑的区域内实现多种试剂的反应,必须对通道的结构进行设计,尽可能地实现试剂的高效混合。

负责流体混合的两个基本机制是扩散和对流。在液体中,单独的分子扩散对于混合效率几乎没有提升作用,而是需要通过对流输送物质来达到更好的混合效果。通过设置障碍物可以使流体在水平方向上的扩散混合距离得以延长,而扩散混合时间的增加对扩散混合效果也有明显的促进作用;还可以改变通道的宽窄和方向,以达到改变流体的流速和方向,进而实现对流体层的拉伸与折叠,以促进混合。根据上述思路,设计了3种混合结构分别为：半圆环式交错结构(见图3)、截圆式交错结构(见图4)和圆环式堆叠结构(见图5)。

(a) 结构轴测图

(a) 结构轴测图

(a) 结构轴测图

管壁障碍物结构主要参数与选值,如表1所示。对以上每一个参考因素d1、d2、d3选择5个参数值进行仿真,确定参数与混合性能的关系。垂直通道半径R=1.5mm,高H=1.44mm(混合区共有8层纸,每层纸厚度约为0.18mm)。考虑到纸芯片制作的精度和折叠对齐时的误差,为保证流动的通道畅通,d1、d2、d3的最大值分别为1200、2000、1200mm。

表1 管壁障碍物结构主要参数与选值Table1 Main parameters and selected values of pipe wall obstacle structure

3 结果与分析

3.1 3种结构的流动混合仿真

3.1.1 混合效果的评价指标

定义评价混合效果的混合强度值Ie[9]为

(1)

3.1.2 3种混合结构的仿真结果

图6是半圆环式交错混合结构在环宽d1为 800、900、1000、1100、1200μm时,每层出口处的Ie的对比图。此外,将没有障碍物的通道作为对照组。结果显示,在此结构下,Ie随着层数增大呈上升趋势。对比不同参数下混合结构末端(第8层出口)的Ie值得出：当环宽d1在 800～1200μm 范围内,随着d1的增大,出口处的Ie值呈现上升趋势;在d1为1200μm时Ie取最大值为0.599 97。

图6 半圆环式交错结构的混合强度值Fig.6 Mixed strength value of semi-circular staggered structure

图7是截圆式交错结构在d2为1600、1700、1800、1900、2000μm时,每层出口处的Ie值对比图。结果显示：在此结构下,Ie值随着微通道层数增加整体呈上升的趋势。对比不同参数下混合结构末端的Ie值得出：当d2在1600 ～ 2000μm范围内,随着d2的增大,出口处的Ie值呈现先增大后减小的趋势,在d2为1700μm时Ie取最大值为0.924 41。

图7 截圆式交错结构的混合强度值Fig.7 Mixed strength value of intercepted circular staggered structure

图8是圆环式堆叠结构在环宽d3为800、900、1000、1100、1200μm时,每层出口处的Ie值对比图。结果显示：在此结构下,Ie值随着层数的增加呈先增后减的趋势。对比不同参数下混合结构末端的Ie值得出：当d3在800～1200μm范围内,随着d3的增大,出口处的Ie值呈现增长趋势,在d3为1200μm时Ie取最大值为0.398 25。

图8 圆环式堆叠结构的混合强度值Fig.8 Mixed strength value of circular stacked structure

图9是半圆环式交错结构、截圆式交错结构和圆环式堆叠结构在最优参数下混合强度值的对比图,将没有障碍物的通道作为空白对照组。结果显示：“d2-1700型”截圆式交错结构的混合强度值Ie最大,混合效果最佳,圆环式堆叠结构的混合强度值Ie最小,混合效果最差。

图9 圆环式堆叠结构的混合强度值Fig.9 The mixed strength value of the best parameters of three structures

对比以上结果,分析其原因如下：

1)截圆式交错结构的障碍物能够将A物质完全引导至B物质入口附近,再同时流向下一层。由于此结构每层之间的通道较窄,因此两物质在流入下一层的过程中,速度会突然变大再变小,使得流体层拉长;流动过程伴随着90°的转向,使得流体层折叠。拉长与折叠可以强化混合效果,所以该结构对混合效果有良好的促进作用。

2)半圆环式交错结构和圆环式堆叠结构使得A、B两物质在第一层未发生完全对流就竖直流入了下一层,且在接下来的几层中,通道结构对速度各分量的变化影响不大,未能引起流体的扰动,使得对流效果较弱,所以直到出口处的混合效果持续表现不佳。

3)在一定范围内,随着结构参数越大,水平方向上流动通道的长度越长,微通道混合强度值越大,对微流体速度方向的扰动越强,导致微流体发生更激烈的拉伸和折叠,对微混合效果起促进作用。但是,随着障碍物的参数超过一定值而继续增大时,流动通道的宽度随之减小,流动阻力成为影响流体流速的主要因素,反而会对扩散和对流产生阻碍作用,导致混合效果有所降低。

3.2 多层纸芯片混合试验

选用甲基橙和甲基蓝两种溶液,滴入“d2-1700型”的三维纸芯片,同时滴入无障碍的通道作为空白对照,展开后观察混合的效果如图10所示。图10(a)是“d2-1700型”结构的混合效果,图10(c)是“d2-1700型”结构出口处的放大效果,图10(b)是作为空白对照组,没有障碍物结构的混合效果,图10(d)是空白组反应区出口处的放大效果。图10(e)是将甲基橙与甲基蓝混合均匀后滴在纸上所得的效果。

(a) 截圆形结构混合效果图 (b) 空白组混合效果图

用图像处理的方法评价多层纸基微流控芯片的混合效果,定义混合强度值Ie为

(2)

式中N—测量区域内的像素点数目;

ci—每个像素点的灰度值;

图11 重复性试验计算混合强度值Fig.11 Calculation of mixed strength value by repetitive tests

3.3 阵列式多层纸基传感器农药检测试验

分别对啶虫脒和丙溴磷两种农药进行可视化检测试验,图12为不同浓度下(0、50、100、200、400、600、800μg/kg)的啶虫脒对适配体-CdTe QDs体系在紫外灯下的荧光响应。上排圆形区域为检测区,下排位对照区。在浓度为0～800μg/kg,随着啶虫脒浓度的增大,检测区CdTe QDs的荧光强度也随之增强,与对照区的差异越来越明显;在600～800μg/kg之间的荧光差距较小,肉眼难以分辨,因此其检测范围是50 ～600μg/kg,检测限是50μg/kg,低于国标中的农药最大残留限量。

图12 啶虫脒浓度(从左到右0～800μg/kg)对适配体-CdTe QDs体系的荧光响应Fig.12 Fluorescence response of acetamiprid concentration (0～800μg/kg) to adaptor -CdTe QDs system

图13为不同浓度下(0、60、120、240、480、720、960μg/kg)的丙溴磷对适配体-CdTe QDs体系在紫外灯下的荧光响应。

图13 丙溴磷浓度(从左到右0～960μg/kg)对适配体-CdTe QDs体系的荧光响应Fig.13 Fluorescence response of profenofos concentration (0～960μg/kg) to adaptor -CdTe QDs system

由图12可知：在浓度为0～480μg/kg内,随着丙溴磷浓度的增大,检测区CdTe QDs的荧光强度也随之增强,与对照区的差异越来越明显;当超过480μg/kg浓度时,反应区与对照区的差异趋于稳定,反应区与对照区荧光强度的差异较小,肉眼难以分辨,说明其检测范围是60～480μg/kg,检测限值是60μg/kg,低于国标中的农药最大残留限量。

4 结论

1)设计了折叠式多层纸基微流控芯片,通过纸张的毛细作用来输送流体,三维纸芯片折叠结构实现液体的层层渗透,除了每层纸内的流动,还可以在两层之间垂直流动。此结构可以使流体能够在一个紧凑的区域内被输送到大量反应场所。

2)设计了半圆环式交错结构、截圆式交错结构和圆环式堆叠结构,对比3种结构的仿真结果,“d2-1700型”截圆式交错结构的对流扩散的效果最好,混合强度值Ie最大,为0.924 41。

3)对不同浓度的啶虫脒和丙溴磷两种农药进行可视化检测试验,测得此芯片对啶虫脒的检测范围是50 ～600μg/kg,对丙溴磷的检测范围是60 ～480μg/kg,均低于国标中的农药最大残留限量。