SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1棘突蛋白抗原表位分析

曾建涛，李 泉，周丽莉，董姗姗，郑兆斌

（1.重庆市长寿区人民医院医学检验科，重庆 401220；2.重庆市长寿区人民医院心内科，重庆 401220）

引发新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的结构与2003年发现的严重急性呼吸综合症冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）有很大的相似性[1]，但与其他毒力较弱的冠状病毒，如人冠状病毒（human coronavirus，HCoV）-OC43、HCoVHKU1在进化树上有较大的距离[2]。有研究结果显示，所有人群都对SARS-CoV-2易感，但由SARS-CoV-2感染引发的COVID-19在儿童中的发病率低于成人，并且整体上临床症状较轻[3]。本研究拟通过SARS-CoV-2与另外2种流行的冠状病毒（HCoV-OC43、HCoV-HKU1）棘突（spike，S）蛋白抗原表位的比较，探讨低毒性冠状病毒是否对SARS-CoV-2有交叉保护作用。

1 材料和方法

1.1 3种冠状病毒S蛋白氨基酸序列及空间结构的来源

SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白氨基酸序列及S蛋白空间结构均从美国国立生物技术信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中下载。

1.2 氨基酸序列比对

采用全局比对软件MAFFT进行多氨基酸序列的比对。

1.3 B细胞抗原表位的预测

B细胞抗原表位采用Protean软件及在线IEDB软件进行计算。线性B细胞抗原表位使用IEDB软件的BebiPred 2.0算法，临界值设置为0.55，设定7个以上连续的氨基酸。BebiPred计算的结果与Protean软件的Plot-Kyte-Doolittle亲水性参数、Plot-Emini表面可及性参数、Jameson-Wolf抗原指数3个参数一起综合分析。构象B细胞表位使用IEDB软件的Discotope 2.0算法，临界值设置为-2.5。

1.4 T细胞抗原表位的预测

T细胞抗原表位采用IEDB软件的MHC-Ⅰ Binding Predictions算法及SYFPEITHI数据库Epitope prediction算法进行预测[4]，氨基酸残基长度定义为默认设置，等位基因选择主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC） -Ⅰ类HLA-A*02.01。

2 结果

2.1 3种冠状病毒S蛋白的氨基酸序列及空间结构数据

选取NCBI数据库中收录的65条完整的SARS-CoV-2 S蛋白序列，多序列比对后选取9条S蛋白无氨基酸重复的序列。系统进化树以QHZ87592.1为标准序列，其他8条S蛋白序列共出现8个位点的突变和1个位点的缺失。突变位点分别为R408I、F157L、H49Y、Y28N、A930V、S247R、S221W和F797C，1个位点缺失为Y144缺失。这些突变和缺失均未分布在受体结合域（receptor binding domain，RBD）区域，对S蛋白与血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的结合无影响。分别选取AIX10763.1和AYN64561.1作为HCoVOC43和HCoV-HKU1的S蛋白序列。3种冠状病毒S蛋白基本特征见表1。

表1 3种冠状病毒S蛋白基本特征

2.2 氨基酸多序列比对结果

在SARS-CoV-2 S蛋白的RBD区域，序列比对显示有较大的缺口，提示这部分区域3种冠状病毒S蛋白氨基酸相似度较低，SARS-CoV-2与HCoV-OC43、HCoV-HKU1的RBD区域有明显差异。在S2亚基的部分区域，SARS-CoV-2与HCoV-OC43、HCoV-HKU1的氨基酸序列相似性较高。3条S蛋白多序列比对结果见图1、图2。

2.3 SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白B细胞抗原表位比较

SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白B细胞抗原表位主要集中在S1亚基，选取打分值最高的5个B细胞抗原表位，相互之间无相似性。见表2。

图1 SARS-CoV-2与HCoV-OC43、HCoV-HKU1的RBD区域氨基酸比对图

图2 SARS-CoV-2与HCoV-OC43、HCoV-HKU1的S2亚基部分区域氨基酸比对图

表2 预测的3种冠状病毒S蛋白B细胞抗原表位

2.4 SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白T细胞抗原表位比较

采用2种方法预测SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S2亚基区域，选取打分值最高的5个T细胞抗原表位，氨基酸序列和启止位点见表3。序列位点的比对见图2。HCoV-HKU1、HCoVOC43的S2亚基T细胞抗原表位与SARS-CoV-2比较，均有一定的相似性，最高相似度为70.0%。

表3 预测的3种冠状病毒S蛋白T细胞抗原表位相似度

3 讨论

冠状病毒分布广泛，是一种常见的可感染人类、禽类等脊椎动物，引起呼吸道疾病和肠道疾病的病原体。2012年国际病毒分类命名委员会根据其遗传学差异和血清学特性将冠状病毒分为α、β、γ、δ 4个群。目前已发现了7种对人类致病的冠状病毒，包括HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63、SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）和SARS-CoV-2。β群冠状病毒包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1等。

S蛋白是冠状病毒的重要蛋白，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，包含2个结构域：受体结合亚基S1和膜融合亚基S2，分别在识别细胞受体及与细胞融合的过程中发挥重要作用。本研究结果显示，SARS-CoV-2与HCoV-OC43、HCoV-HKU1受体结合区域的氨基酸明显不同，表明SARSCoV-2与其他2种病毒识别的细胞受体不同。在公布的SARS-CoV-2氨基酸序列中，突变和缺失位点均不在RBD区域，因此突变对SARS-CoV-2 S蛋白与易感细胞ACE2的结合无影响。

冠状病毒通过S蛋白与易感细胞表面受体结合后，入侵细胞，造成感染，同时诱发机体的免疫应答。本研究结果显示，S蛋白包含多种抗原表位，可能在诱导细胞免疫和体液免疫中有重要作用。体液免疫是以效应B细胞产生抗体发挥免疫作用。B淋巴细胞表面的抗原受体与病毒的B细胞抗原表位相结合后，刺激特异的B淋巴细胞克隆增殖，产生相应的抗体。本研究结果显示，3种冠状病毒的B细胞抗原表位主要集中在S1亚基，但相互间无相似性，提示3种冠状病毒S蛋白抗原刺激B淋巴细胞产生的抗体可能无交叉反应性。

细胞免疫主要由T淋巴细胞介导。细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）在抗病毒感染中起着重要作用。人CTL细胞的特征性表型为CD8+T细胞。CTL通过T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别MHC-Ⅰ类分子提呈的抗原肽，通过穿孔素、颗粒酶和FasL途径引起DNA断裂及靶细胞凋亡，特异性杀伤被特定病毒感染的靶细胞。在对抗原应答的后期，绝大多数效应T细胞发生凋亡，少数T细胞分化成记忆性T细胞，介导再次免疫应答。

传统的免疫学观点为“1种克隆型只有1种特异性”，但最近的研究结果表明TCR-肽-MHC之间的相互作用并不是严格保守的，在结合规则内有相当大的灵活性[5]，这为T细胞的交叉免疫提供了可能性。有研究结果显示，一种T细胞克隆可以通过相似的抗原肽段靶向多种感染，这被称为异源免疫[6]，如暴露过流感病毒的人群可以对新型H7N9 流感病毒产生免疫保护[7]。

GUAN等[8]分析了1 011例SARS-CoV-2感染患者，＜14岁的患者仅占0.9%，占重症患者的比例为0.6%。有研究结果显示，HCoV-OC43和HCoV-HKU1常在冬春季节流行，造成呼吸道感染[9]，虽然各年龄组均可发生感染，但儿童的阳性率高于成人[10]，这表明儿童更易被HCoVOC43、HCoV-HKU1等低毒性冠状病毒感染。MHC-Ⅰ类分子结合由8～10个氨基酸组成的肽。本研究结果显示，3种冠状病毒S2亚基的T细胞抗原表位肽有一定的相似性，最高相似度可达70.0%。这些抗原表位可能是3种冠状病毒的共同抗原，HCoV-OC43和HCoV-HKU1致敏的记忆T淋巴细胞可能对SARS-CoV-2感染有交叉保护作用。

综上所述，SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白RBD区域有较大的差异，S蛋白的B细胞抗原表位无相似性，但S蛋白S2亚基的T细胞抗原表位有较高的相似度，最高相似度为70.0%，这对于SARS-CoV-2疫苗的研制有一定的价值。