循环KRAS突变检测在结直肠癌患者新辅助治疗疗效中的临床价值探讨

房永贇，卢大儒，沈立松

（复旦大学生命科学学院，上海 200438）

目前，临床对结直肠癌的治疗难点之一是局部晚期结直肠癌。为了提高局部晚期结直肠癌的手术根治性切除率，并有效降低术后局部复发率，术前进行标准化的同步放化疗，即新辅助治疗，已经成为这类患者的标准治疗方式。新辅助治疗后的评效对于预测手术的根治性切除率和制定有效的术后辅助治疗策略都至关重要。目前常用的评效方法是基于影像学或术后组织学分级来开展的。外周血循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）近年已成为肿瘤分子诊断新的研究热点，其能够更灵敏地、更特异地反应肿瘤细胞的体内负荷，从而提示不同治疗方式对肿瘤的治疗效果。原癌基因（V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog，KRAS）在肿瘤细胞生长过程中起重要调控作用，正常KRAS可抑制肿瘤细胞生长，但KRAS突变会持续刺激肿瘤细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤发生。本研究初步探讨ctDNAKRAS突变丰度变化在评价新辅助治疗疗效方面的潜在应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取河南省肿瘤医院2016年3月—2018年6月住院的结直肠癌患者。入组标准：（1）经病理学诊断及影像学检查证实为结直肠腺癌；（2）经盆腔磁共振成像平扫加增强和/或直肠腔内B超提示，肿瘤浸润深度为T3～T4期和/或有淋巴结转移；（3）经全面检查发现原初转移；（4）患者年龄≥18岁且≤70岁；（5）前期尚未接受任何抗肿瘤治疗，未发现明显放、化疗及手术禁忌症，能够且愿意接受新辅助治疗；（6）签署了知情同意书，并能够提供新辅助治疗前、后外周血。排除标准：（1）肿瘤组织经分子诊断为KRAS野生型；（2）新辅助治疗前外周血ctDNA中未检测出KRAS突变；（3）因各种原因中断了新辅助治疗及后续手术（如患者无法耐受新辅助治疗或新辅助治疗过程中出现疾病进展无法手术等），无法获得影像学或病理学评估数据。

1.2 方法

采用ddPCR KRAS Screening Multiplex Kit（美国Bio-Rad公司）检测KRAS突变，其可以有效地检测7种最常见的KRAS突变（包括G12A、G12C、G12D、G12V、G12R、G12S、G13D）和野生型KRAS；采用MagicPure cell-free DNA Kit（北京TransGen Biotech公司）抽提ctNDA，取10 ng ctDNA后，根据试剂盒说明书的要求配制成聚合酶链反应（polymerase chian reaction，PCR）反应体系，随后加到微滴发生卡（美国Bio-Rad公司）中的样品孔内，并在底层的油滴孔中各加入70 μL的微滴生成油，然后在QX200 Droplet Generator（美国Bio-Rad公司）中制备成微滴，并在QX20数字PCR仪（美国Bio-Rad公司）上进行扩增。PCR结束后将孔板放入QX200 Droplet Reader（美国Bio-Rad公司）中检测荧光信号，并利用Quanta Soft（美国Bio-Rad公司）判读并计算KRAS突变序列在整个PCR反应体系中的突变频率（mutant-allele frequency，MAF）。

分别采集入组患者在接受新辅助治疗前1天及完成新辅助治疗后1周清晨空腹静脉血10 mL于促凝管中，1 509×g离心10 min后分离血清待检，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA与糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）采用Cobas 6000全自动电化学发光仪及其配套试剂（瑞士Roche公司）进行检测，当日质控，以保证结果的有效性。参考区间：CEA＜5 ng/mL，CA19-9＜37 U/mL。

1.3 疗效评价标准

基于胸、腹、盆腔电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）开展新辅助治疗的疗效评价，参考罗亚红等[1]的RECIST标准针对直径≥20 mm的病灶在新辅助治疗前、后影像学的变化进行分类：（1）完全响应（complete response，CR），即已知肿瘤病灶完全消失；（2）部分响应（partial response，PR），即目标病灶最长径之和减少＞30%；（3）疾病进展（progressed disease，PD），即目标病灶最长径之和增加＞20%；（4）疾病稳定（stable disease，SD），即变化介于PD和PR之间。

将入组患者新辅助治疗后接受手术切除的肿瘤组织样本按照每厘米取材1次切片，交由至少2位病理学专家独立评分。分级主要依据镜下残留肿瘤细胞和纤维化的比例，参照美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版的肿瘤分级（tumor regression grading，TRG）评分系统[2]，分为4级：（1）完全退缩（TRG0），即镜下未见肿瘤细胞；（2）中等退缩（TRG1），即镜下仅见单个或小灶肿瘤细胞；（3）轻微退缩（TRG2），即有肿瘤残留但少于纤维化间质；（4）无退缩（TRG3），即无或有少量肿瘤细胞坏死，存在广泛的残留肿瘤。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示，组间比较采用配对t检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入组患者的疾病特征及新辅助治疗疗效评价结果

入组患者中T3和T4期的患者分别为25例和28例；根据影像学评估，有2例（4%）患者为CR，40例（75%）患者为PR，9例（17%）患者为SD，2例（4%）患者为PD。术后肿瘤组织病理学评效诊断中TRG0、TRG1、TRG2和TRG3的患者分别为2例（4%）、38例（72%）、7例（13%）和6例（11%）。影像学评效为CR、PR或PD的患者，均在术后肿瘤组织病理学评效诊断中相应地被评为TRG0、TRG1或TRG3。见表1。

2.2 入组患者的外周血ctDNA KRAS突变在新辅助治疗前、后的变化

入组患者组织检测为KRAS突变，新辅助治疗前外周血微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）检测ctDNAKRAS突变，检出率为100%。ddPCR检出的外周血ctDNAKRAS的MAF在患者接受新辅助治疗前、后发生变化，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 MAF差值（治疗前MAF-治疗后MAF）与影像学评效比较

表1 入组患者的基本特征

以MAF差值为因变量，采用最小显著性差异法（least-significant difference，LSD）做MAF差值与影像学评效的比较分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 MAF差值与病理学评效多重比较

以MAF差值为因变量，采用LSD做MAF差值与病理学评效的比较分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.5 患者血清学检测结果评效

用患者CEA和CA19-9变化差值（均为新辅助治疗前-治疗后）分别与影像学和病理学评效作比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 外周血ctDNA KRAS突变在新辅助治疗前、后的变化

表3 MAF差值与影像学评效多重比较

表4 MAF差值与病理学评效多重比较

3 讨论

对于局部晚期结直肠癌患者而言，新辅助治疗的优点为：（1）在肿瘤各级血管未损伤前予以化疗，可提高局部化疗药物的浓度；（2）可有效治疗临床或亚临床的微小转移灶，减少术后的复发和转移；（3）降低临床分期，缩小原发病灶，增加手术机会；（4）确定肿瘤对化疗药物的敏感性，以指导制定术后治疗计划。但新辅助治疗也可能因为肿瘤的早期进展，使患者错过了手术的窗口期。可见针对新辅助治疗的疗效进行及时而准确的评估，才能够充分发挥新辅助治疗的优点，正确指导后期的治疗[3]。

新辅助治疗的评效有多种方法，血清学指标（CEA和CA19-9）被认为是可用于判断病情发展的重要指标之一[4]。在本研究中，我们也发现CEA和CA19-9的水平对于新辅助治疗较为敏感，疾病得到有效控制的患者（影像学评效出现CR、PR、SD或病理学评效出现TRG0、TRG1、TRG2的患者），血清学指标大都发生了较显著的变化。这充分说明了血清学指标在评价治疗效果上具有一定的价值[5]。但是我们还发现，血清学指标的变化并不能清晰地对应于不同程度的治疗效果，如1例患者影像学评效为PR，病理学评效为TRG1，而CEA指标却上升了44.4%。血清学标志物的的另一个不足之处在于，有相当一部分患者血清标志物为阴性，无法用于监测。

影像学技术的不断发展和普及使影像学评效成为最常见的用于指导新辅助治疗疗效评估的方法[6]。RECIST标准明确了病灶测量方法，并能够有效地综合评估多个病灶对于治疗的响应。本研究中的53例患者中，有42例患者影像学评效为CR和PR，其中41例（98%，41/42）在新辅助治疗后外周血ctDNAKRASMAF相比新辅助治疗有所下降，这4例患者中有2例为CR，39例为PR；仅1例（2%，1/42）出现新辅助治疗后外周血ctDNAKRASMAF轻微上升（由2.38%上升到2.41%），该患者的影像学评效为PR。53例患者中，有11例影像学评效为SD和PD，其中5例（45%，5/11）在新辅助治疗后外周血ctDNAKRASMAF相比新辅助治疗前下降，影像学评效均为SD，另外6例（55%，6/11）新辅助治疗后外周血ctDNAKRASMAF上升，其中4例SD、2例PD，说明影像学评效并不能显著区分SD和PD的情况。

病理学评效作为一种最直观、最准确的肿瘤治疗反应评价标准，对预后有重要参考价值，但其缺点是存在滞后性及评价标准存在主观因素[7]。本研究的53例患者中，肿瘤显著退缩为40例（包含2例TRG0和38例TRG1的患者），其中39例（98%，39/40）在新辅助治疗后外周血ctDNAKRASMAF相比治疗前有所下降，仅1例（2%，1/40）患者出现新辅助治疗后外周血ctDNAKRASMAF轻微上升（由2.38%上升到2.41%），该患者的退缩评级为TRG1，对于这例患者，需要后期进一步随访其复发情况后进行综合解释。肿瘤未显著退缩（包含TRG2和TRG3）的13例患者中，有7例（54%，7/13）在新辅助治疗后外周血ctDNAKRASMAF低于治疗前，其中4例为TRG2、3例为TRG3；另外6例（46%，6/13）患者治疗后外周血ctDNAKRASMAF升高，其中3例TRG2、3例TRG3。

影像学评效与金标准的病理组织学评效总体上高度一致[1，8]。其CR、PR和PD分别有效地对应于组织病理学评效的TRG0、TRG1、TRG3。最大的差别主要来自于影像学评效提示SD的患者，组织病理学评效可能包含了TRG1、TRG2、TRG3的可能。这种不一致充分说明了肿瘤大小变化不能完全反映新辅助治疗后肿瘤生物学性质变化，解剖学改变比功能改变要慢。而由于ctDNA来自凋亡肿瘤细胞的DNA碎片，且半衰期较短，因此相比影像学更能够实时反映肿瘤的功能学变化。

综上所述，影像学评效为SD的患者外周血ctDNAKRAS突变的变化趋势与组织病理学评效得到的治疗效果一致，能有效弥补影像学评效的不足之处，也能反映出肿瘤对于新辅助治疗的响应和肿瘤负荷的变化，区分SD和PD。因此，在新辅助治疗阶段监测外周血ctDNAKRAS突变，能够有效地评估肿瘤的治疗效果。外周血ctDNAKRAS突变作为一种新的分子评效手段能有效补充传统的治疗评价标准，协助临床制定更精准的治疗策略[9]。由于本研究的病例较少，且选择的是外周血ctDNAKRAS突变患者，后续研究应该采用更广泛的突变检测手段，明确外周血ctDNAKRAS突变在新辅助治疗疗效中的临床应用价值。