Linc00704对结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

陈萍 梁俊荣 汪鑫 李丹秀 王琦 曹田宇 周金池 赵晓迪 卢瑗瑗 王新

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡率的第二致死因素，且发病率和死亡率近年来呈增长趋势［1］。CRC有手术、放疗、化疗和靶向药物等治疗方法，早期患者疗效较好，但晚期患者疗效并不理想。因此，寻找可用于早期诊断、治疗和预后评估的新型生物学标志物尤为重要［2］。lncRNA（long non-coding RNA）是长度>200 个核苷酸的转录物，具有低或无蛋白编码潜能，可形成多种转录本，通过与蛋白质、染色质甚至RNA本身的相互作用调节一系列细胞功能［3］。研究发现，lncRNAs在肝癌、肺癌，包括结直肠癌等多种肿瘤中异常表达［4-6］。其中，Linc00704是一种有丝分裂相关的长非编码RNA（mitotically-associated lncRNA，MANCR），位于 10号染色体，最长转录本为1 528 bps，包含4个外显子。本课题组前期利用三维立体细胞培养模型培养结肠癌HCA-7细胞，用EGFR单抗西妥昔筛选获得敏感结肠癌细胞［7］，且结肠癌细胞经西妥昔单抗处理后经转录组测序发现Linc00704表达下降约90%，因此推测Linc00704可能在结直肠癌发生发展中发挥重要作用。本研究在此基础上进一步探讨Linc00704对结直肠癌细胞增殖、侵袭及迁移等功能的影响，以期为阐明结直肠癌发病机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

27对配对结直肠癌组织、癌旁组织样本均来自空军军医大学西京消化病医院。正常永生化人结肠上皮细胞系FHC和结直肠癌细胞系NCI-H716、SW480、SW48、SW1463、Caco-2、DLD-1、HCT15、RKO 均为本实验前期保存。反义寡核苷酸（antise oligonucleotide，ASO）序列由广州锐博生物公司合成。Linc00704过表达慢病毒由上海吉凯基因公司合成。Linc00704引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。转染试剂HiPerFect、RNA提取试剂盒miRNeasy Mini Kit购自QIAGEN公司；逆转录试剂盒5X PrimeScript RT Master Mix及PCR引物均购自TaKaRa公司；Real-time PCR 试剂 Hieff qPCR SYBR Master Mix（No Rox）购自YEASEN公司；Transwell迁移小室购自Millicell公司；Invasion小室购自CORNING公司；Cell Counting Kit-8购自DOJINDO Laboratories公司。

1.2 细胞培养及转染

细胞在含10%胎牛血清、1%二抗、1%谷氨酰胺（100×）、1%非必需氨基酸溶液的DMEM培养液中培养，培养条件 5% CO2、37℃，待细胞汇合至85%～95%时消化传代。转染ASO序列下调Linc00704表达：于6孔板中按每孔50 nmol沉默Linc00704的反义寡核苷酸序列（ASO-Linc00704）或阴性对照、5 μL/孔转染试剂HiPerFect与Opti-MEM培养液制备混悬液转染Caco-2、DLD-1细胞，48 h后收集细胞行RT-qPCR检测验证Linc00704的转染效率。ASO-Linc00704序列为 5′-CCGAAACTTGCCATTT-3′。转染 ASO 序列后的细胞系分别命名为阴性对照组（ASO-NC组）、ASO-Linc00704组。感染过表达慢病毒：6孔板中贴壁细胞生长约40%时，按细胞MOI=10计算Linc00704的病毒量，加入含40 μL/mL感染增强液的DMEM培养基，混匀后加入6孔板内。72 h后加入嘌呤霉素进行筛选，RKO细胞加入2 μg/mL嘌呤霉素；HCT15细胞加入5 μg/mL嘌呤霉素，1周后行RT-qPCR检测以验证转染效率。感染过表达慢病毒后各细胞系分别命名为阴性对照组（NC组）、过表达Linc00704组（Linc00704组）。

1.3 RT-qPCR检测结直肠癌中Linc00704 mRNA的表达水平

收集结直肠癌组织及转染48 h后的细胞，按照RNA提取试剂盒说明提取总RNA。分光光度计测定RNA浓度及纯度后按照反转录试剂盒说明进行反转录，条件为37℃反转录15 min，85℃灭活反转录酶5 s。反转录后模板用两步法进行扩增，扩增条件：95℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，60 ℃延伸 30 s，40个循环。Linc00704上游引物为 5′-TGTTGGAGGATACCTGTGCAT-3′，下游引物为5 ′-TGCCATTCCCAGATTGTGGAG-3′；内参 GAPDH上游引物为 5′-GCACCGT-CAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物为 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。实验重复 3 次。采用 2-△△Ct法计算Linc00704 mRNA的表达量。

1.4 CCK-8法检测细胞的增殖能力

收集转/感染48 h后的细胞分别以1 000/孔铺于6个96孔板中，每组细胞设5个复孔，分别在铺板后0 d（12h）、1d（24 h）、2 d（48 h）、3 d（72 h）、4 d（96 h）、5 d（120 h）各取1板，并将每孔换成100 μL培养液+10 μL CCK-8试剂的混合液，并取96孔板中的5个空白孔加入上述混合液做空白对照，继续孵育2 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD）值。根据吸光度绘制生长曲线。

1.5 Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力

Transwell迁移实验：收集转染ASO-Linc00704 48 h后的 Caco-2、DLD-1细胞及Linc00704过表达的RKO、HCT15细胞，重悬细胞，计数，调整细胞浓度为5×105/mL。取Transwell小室置入24孔板中，下层加入600 μL含20%胎牛血清的完全培养基，上层加入200 μL上述重悬细胞，置于孵箱常规培养，Caco-2、DLD-1细胞培养22 h后取出，RKO、HCT15细胞培养52 h后取出，小室用PBS清洗2遍，加入1 mL 95%的乙醇固定5 min，再用PBS洗1次后，加入含有 1 mL的结晶紫溶液染色5 min，PBS清洗，用湿棉签轻轻擦去小室内贴壁细胞，置于显微镜下观察，随机选取3个视野拍照，计数所穿出的细胞。Transwell侵袭实验：使用Invasion小室，Caco-2、DLD-1细胞培养24 h后取出，RKO、HCT15细胞培养100 h后取出，其余步骤同迁移实验。

1.6 统计学方法

采用IBM SPSS Statistic 23.0软件进行统计学分析。结直肠癌组织及癌旁正常组织中Linc00704 mRNA的比较采用配对t检验方法。结直肠癌细胞和正常结肠上皮细胞系Linc00704 mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析。两组Linc00704 mRNA表达水平、迁移、侵袭数据的比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Linc00704在结直肠癌组织及细胞系中的表达

RT-qPCR检测结果显示，相比正常癌旁组织，Linc00704在结直肠癌组织中表达明显降低（2.393±0.821 vs 15.94±3.989，t=4.103，P＜0.001），见图 1A。正常结肠上皮细胞系FHC和结直肠癌细胞系（RKO、HCT15、NCI-H716、SW480、S W1463、SW48、Caco-2、DLD-1）中有6种细胞Linc00704表达水平明显降低（F=44.750，P＜0.001），见图 1B。本研究选取 Linc00704表达水平相对较低的RKO、HCT15及较高的结直肠癌细胞系Caco-2、DLD-1进行后续实验。

图1 Linc00704在结直肠癌组织及细胞系中的表达Fig.1 Expression of Linc00704 in colorectal cancer tissues and cell lines

2.2 构建Linc00704下调及过表达结直肠癌细胞系

RT-qPCR检测结果显示，在Caco-2、DLD-1细胞中，ASO-Linc00704组的Linc00704 mRNA相对表达量均低于 ASO-NC 组（均 P＜0.01）。Caco-2、DLD-1细胞的沉默效率分别为（73.4±2.2）%、（81.9±3.7）%，见图 2A～B。在 RKO、HCT15细胞中，Linc00704组的Linc00704 mRNA相对表达量均高于NC组（均P＜0.001）。RKO、HCT15细胞的过表达效率分别为（1 423 900±71 690）%、（2 574 500±78 770）%，见图 2C～D。说明构建Linc00704下调及过表达模型成功，可用于后续功能实验。

图2 沉默Linc00704及过表达Linc00704细胞的转染效率Fig.2 Transfection efficiency of silencing or overexpressing Linc00704 cells

2.3 下调及过表达Linc00704对结直肠癌细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示，在Caco-2、DLD-1细胞中，ASO-NC组与ASO-Linc00704组细胞的OD值比较差异无统计学意义（P=0.465；P=0.257）。在 RKO 与HCT15细胞中，NC组与Linc00704组细胞的OD值比较差异亦无统计学意义（P=0.334；P=0.490）。见图3。

图3 结直肠癌Caco-2、DLD-1、RKO、HCT15细胞的生长曲线Fig.3 Growth curves of colorectal cancer Caco-2,DLD-1,RKO and HCT15 cells

2.4 下调及过表达Linc00704对结直肠癌细胞迁移与侵袭的影响

Transwell迁移及侵袭实验显示，在Caco-2、DLD-1细胞中，ASO-Linc00704组细胞迁移穿膜数及细胞侵袭穿膜数均较ASO-NC组增多（均P＜0.001），见图4A～B。在 RKO、HCT15细胞中，Linc00704组细胞迁移穿膜数及细胞侵袭穿膜数均较NC组减少（均P＜0.001），见图 4C～D。

3 讨论

图4 Linc00704对结直肠癌细胞迁移及侵袭的影响Fig.4 Effect of Linc00704 on migration and invasion of colorectal cancer cells

越来越多的研究证实lncRNA可通过参与表观遗传、转录及转录后调控等在细胞形态、结构和功能过程中发挥重要作用，也能通过相互作用参与恶性肿瘤的发生发展［2-3，8-9］，因此 lncRNAs的异常表达可能是肿瘤发病的机制。lncRNAs在结肠癌靶向治疗及生物学预测方面同样具有重要的临床意义。作为一种lncRNA，Linc00704被发现在多种恶性肿瘤如乳腺癌、甲状腺癌、胃癌和肝癌等高表达，且与恶性表型及不良预后相关［10-14］。在乳腺癌中，TRACY 等［12］通过搜索TCGA数据库发现Linc00704低表达患者的10年生存率较Linc00704高表达患者明显降低，与预后不良相关。以上研究提示Linc00704可能有促癌作用。本研究检测Linc00704在CRC癌组织及癌旁组织中的表达，发现Linc00704在癌组织中低表达，检测8种CRC细胞系同样发现有6种细胞系的Linc00704表达较正常结肠上皮细胞系FHC降低，提示Linc00704低表达与CRC癌变密切相关，且Linc00704可能发挥促癌及抑癌的双重作用。

既往研究报道lncRNA失调在CRC细胞增殖、血管生成、转移、侵袭、凋亡、干性和基因组不稳定性等方面具有重要作用［15］。ZHANG等［11］通过质粒过表达Linc00704后发现可促进肝癌细胞迁移和侵袭，但对细胞增殖无明显影响。YAO等［10］通过质粒过表达Linc00704后发现可促进胃癌细胞增殖，并通过下调miR-101而促进胃癌发生，但未进行细胞迁移及侵袭功能实验。本研究体外功能实验结果发现，Linc00704表达对增殖无明显影响，但下调Linc00704表达可促进CRC细胞迁移及侵袭，而过表达Linc00704可抑制CRC细胞的迁移及侵袭，提示Linc00704表达升高可抑制CRC进展，这与其在结肠癌组织及细胞系中低表达结果一致，但调节CRC生物学行为的具体机制尚不清楚。本研究未发现Linc00704表达对细胞增殖能力的影响，考虑原因为lncRNAs细胞定位与其功能有关，亚细胞定位的差异可能导致其在CRC中的功能不同［16-18］。因此，对于Linc00704的亚细胞定位仍需进一步研究。

综上所述，本研究发现Linc00704在结直肠癌细胞和癌组织中下调，其过表达可抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭能力，可能是CRC诊断及治疗的新靶点，但其作用机制仍未知，后续将进一步在体内验证其作用。