miRNA-9 对胃癌细胞增殖和迁移的作用研究

周建萍，余猛进，毛振彪

1解放军海军军医大学（第二军医大学）第一附属医院急诊科，上海200433

2南通大学附属医院消化科，江苏 南通2260010

胃癌是人类最常见的癌症之一，2012 年胃癌新发病例近100 万例，居全球常见恶性肿瘤第五位。70%以上的胃癌病例发生在发展中国家，其中一半发生在东亚（主要是中国）。胃癌是全球男性和女性因癌症死亡的第三大死因，估测中国是世界上胃癌发病率和病死率最高的国家[1]。胃癌发病率随年龄增长而增长显著，发病高峰年龄为60～74 岁；然而，目前其在30 岁以下人群中越来越普遍。中国胃癌的发病率和病死率明显高于其他国家，预后普遍较差。2015 年，中国年龄标化后的胃癌发病率和病死率在所有肿瘤中居第二位。人口增长和老龄化导致大量新发病例，幽门螺杆菌感染可能会导致胃癌发生[2]。近几十年来，已报道大量的微小RNA（microRNA，miRNA）与胃癌有关。miRNA 主要通过抑制靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）翻译或mRNA 降解参与肿瘤的发生发展[3]。最近的研究表明，miRNA可能作为潜在的致癌基因或抑癌基因在人类癌症中发挥重要作用[4]。miRNA 是由18～24 个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA，结合在与之互补的mRNA 3'非编码区（untranslated region，UTR）或5'UTR，与蛋白质因子形成RNA 沉默复合物，导致mRNA 降解或翻译抑制，从而在转录后水平调节基因表达[5]。miRNA 调节细胞分化、增殖和凋亡，其异常表达促进细胞增殖，阻滞细胞周期，抑制细胞凋亡，诱导肿瘤血管生成[6]。真核生物miRNA 调节mRNA，大量证据表明人类癌症中miRNA 突变或欠表达，提示miRNA可能为肿瘤致癌基因或抑癌基因[7]。本研究使用miRNA-9 转染人胃癌细胞株，并分别采用CCK-8和Transwell 法检测胃癌细胞的增殖和迁移能力。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞株MKN-45 购自中国科学院上海细胞库；根据Geen Bank 提供的miRNA-9 序列，miRNA-9 质粒由上海吉玛公司合成。CCK-8 试剂盒购自beyotime 公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；DMEM、RPM1640 培养基均购自Hyclone 公司；无内毒素的少量质粒抽提试剂盒购自Omega 公司；Lipofectamine 2000 试剂盒购自invitrogen 公司。

1.2 细胞培养及转染

常规培养传代，取传代2、3 次且生长良好的对数生长期细胞，以5×106/ml 接种到6 孔培养板无抗完全培养基培养24 h。预实验确定250 ml 无血清培养基稀释4.0 mg DNA，8 ml Lipofectamine 2000稀释250 ml无血清培养基，二者混合后总体积500 ml。将脂质体和DNA 混合物逐滴加入到每孔中，充分混匀。37 ℃5%CO2培养箱孵育6 h，更换培养基，MKN-45 细胞株加入混合物48 h，荧光显微镜下观察转染效率。

1.3 质粒抽提

重组质粒转化，摇菌，质粒小量抽提，制备质粒的过程即裂解细菌、分离、收集、纯化质粒的过程。先用强热或酸、碱等化学物质破坏细胞壁，使细菌染色体DNA 变性并缠绕附着在细胞碎片上或被切断成不同大小的线性片断。外界条件恢复正常时，线状染色体DNA 片段难以复性，而质粒DNA 双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，溶解在液相中，再通过树脂吸附等方法将其分离。使用无内毒素的少量质粒抽提试剂盒获得，具体操作步骤按照说明书进行。

1.4 CCK-8 检测细胞增殖

实验分为4 组：miRNA-9 类似物组、miRNA-9抑制物组、阴性对照组、空白对照组（MKN-45 细胞加新鲜的DMEM培养基）。取MKN-45细胞株对数生长期细胞，调整细胞密度为5×105/ml 接种至6 孔板，次日长满，分别将miRNA-9类似物、miRNA-9抑制物、阴性对照质粒按照Lipofectamine 2000 说明书转染MKN-45 细胞株。12 h 后胰酶消化，调整细胞密度为2×103/ml 细胞悬液接种至96 孔板，无抗完全培养液定容至每孔100 ml，于37 ℃5%CO2培养箱培养。调零组为无抗完全培养液，每组设6 个复孔，分别在24、48、72 h 测定吸光度，测定前避光加CCK-8 每孔10 ml，37 ℃5%CO2培养2 h，终止培养，酶联免疫检测仪测定450 nm 波长下的吸光度，去掉极端值，实验重复3 次，取均值。

1.5 Transwell 法检测细胞迁移

制备细胞悬液，调整细胞密度1×105/ml。取MKN-45 细胞悬液200 ml 接种于Transwell 小室。24 孔板下室加入600 ml 含20%磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）的培养基，常规培养24 h。结果统计使用直接计数法，取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS 清洗2 遍，甲醇固定30 min，将小室适当风干，0.1%结晶紫染色固定20 min，棉签轻轻擦掉小室上层未迁移细胞，PBS 清洗3遍。100 倍倒置显微镜下随机选取5 个视野观察细胞。实验重复3 次，取均值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用重复测量方差分析，以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-9 质粒转染胃癌细胞株MKN-45 的效率测定

使 用Lipofectamine 2000 转 染，转 染48 h 后MKN-45 细胞株转染效率达到90%（图1），细胞损伤最低，转染时间过久，易出现细胞凋亡。

图1 阴性对照质粒转染胃癌MKN-45细胞株（×100）

2.2 质粒检测

质粒DNA 浓度和纯度测定吸光度值A260∶A280=1.8～1.9，如高于此范围，说明有残余蛋白质存在，低于此范围提示混有RNA。2%琼脂糖凝胶电泳，质粒DNA 以3 种形式存在，即环状DNA、线状DNA、超螺旋DNA。miRNA-9 质粒分子量为5702 bp，质粒电泳说明提取质粒符合实验要求。

2.3 miRNA-9 对MKN-45 细胞增殖的影响

转染48、72 h 时计算细胞增殖率，miRNA-9 类似物组细胞增殖率分别为（60.233±4.366）%、（114.063±1.730）%，miRNA-9 抑制物组细胞增殖率分别为（22.216±5.583）%、（59.637±8.542）%。结果显示miRNA-9 类似物组细胞增殖率高于阴性对照组和空白对照组（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同时间点各组MKN-45 细胞的增殖率（%±s）

表1 不同时间点各组MKN-45 细胞的增殖率（%±s）

组别miRNA-9类似物组miRNA-9抑制物组阴性对照组空白对照组转染24 h 6.045±5.363 12.309±7.326 10.520±8.061 8.5678±6.735转染48 h 60.233±4.366 22.216±5.583 25.742±7.835 40.756±7.876转染72 h 114.063±1.730 59.637±8.542 72.764±15.698 90.333±14.395

2.4 miRNA-9 对MKN-45 细胞迁移的影响

分别计数转染48 h 后各组穿过滤膜的细胞数，结果显示miRNA-9 类似物组穿膜细胞数为（1052±71）个，miRNA-9 抑制物组为（276±32）个，阴性对照组为（595±42）个，空白对照组为（613±35）个，miRNA-9 类似物组穿膜细胞数较空白对照组、阴性对照组增多。（图2）

图2 Transwell迁移实验观察各组MKN-45细胞的迁移能力（结晶紫染色，×100）

3 讨论

癌症是由致癌基因、抑癌基因和miRNA 改变而引起的[8]。肿瘤相关基因的异常调节、基因增加或缺失、异常的蛋白质翻译导致致癌基因过表达和抑癌基因下调[9]。miRNA 的异常表达促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱导肿瘤血管生成；miRNA存在于不同肿瘤亚型，如结肠癌、胃癌等。胃癌组织通过miRNA 簇抑制细胞周期[10]。本研究以miRNA-9 为研究对象，研究焦点集中在预测靶基因和相关的miRNA。

miRNA-9 有3 种亚型，即miRNA-9-1、miRNA-9-2、miRNA-9-3；根据Gene Bank 可知它们都有CpG 岛，其成熟体序列一样，功能相似。在胃癌组织中发现其DNA 高度甲基化导致表达降低[11]。Tsai 等[12]研究表明，miRNA-9 是胃癌的抑癌基因，5-Aza-dC 去甲基化处理增加了miRNA-9 的表达，可抑制胃癌细胞增殖、迁移和浸润。Wan 等[13]发现miRNA-9 在人胃腺癌组织中表达降低，miRNA-9过表达明显抑制人胃癌细胞株和裸鼠肿瘤生长，miRNA-9 抑制核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）mRNA 和蛋白表达，提示其作为肿瘤抑癌基因发挥作用。

本研究发现，转染miRNA-9 后，miRNA-9 对MKN-45 胃癌细胞的生物学行为有显著影响。CCK-8 和Transwell 检测显示，过表达miRNA-9 可促进胃癌细胞的增殖和迁移能力，而下调miRNA-9则降低胃癌细胞的增殖和迁移能力，表明miRNA-9在MKN-45 细胞中起致癌基因的作用。miRNA-9表达在其他肿瘤中上调，表明其作用可能与致癌基因类似。在结肠癌细胞中，miRNA-9 抑制E-钙黏蛋白表达，抑制miRNA-9 可恢复E-钙黏蛋白活性；在E-钙黏蛋白表达降低的结肠癌标本中，miRNA-9 表达显著增加[14]。此外，miRNA-9 上调乳腺癌细胞中的E-钙黏蛋白表达，增加细胞迁移和侵袭性。miRNA-9 介导的E-钙黏蛋白下调导致血管内皮生长因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）表达上调和肿瘤血管生成。此外，在miRNA-9 过表达的乳腺癌小鼠模型中发现肺转移，在高度恶性细胞中抑制miRNA-9 可以抑制转移[15]。本研究结果与以上结论一致。Gao 等[16]认为miRNA-9 在胃癌组织和细胞系中的表达均低于癌旁组织和未分化胃上皮细胞，体内和体外实验表明过表达miRNA-9 可抑制胃癌细胞和组织的增殖。目前发现很多未分化胃癌病例，存在胃上皮细胞内miRNA-9 基因突变，因此推测miRNA-9 起双重作用，也许取决于目标靶基因及肿瘤类型。将来将建立动物模型，进一步研究miRNA-9 和靶基因的相关性。