基于气相-离子迁移谱技术快速鉴定黄酒酒龄及品牌

顾 双 任 芳 韦真博 张振方 王本友 朱璐艺 王 俊*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州310058 2 济南海能仪器股份有限公司 济南251500）

黄酒是中华民族传统的酿造酒，与啤酒、葡萄酒并称为“世界三大古酒”[1]。黄酒是一种以稻米为原料酿造成的粮食酒，不经过蒸馏工序，酒精含量低于20%[2]。因其酒精度低，又具有很高的营养价值而深受消费者青睐。由于黄酒的风味和质量随着贮藏年份的增加而提高，因此黄酒行业内常以酒龄来评定黄酒的品质好坏[3-4]。然而，市售黄酒中常存在生产加工过程中偷工减料，虚报酒龄及产地等现象，扰乱了黄酒市场，严重影响了黄酒的声誉，因此亟待找到一种快速准确检测黄酒酒龄及产地的方法。

黄酒酒龄及产地分析一般通过感官品评来进行，此方法必须由经过训练和有经验的评酒师评定[5]，并且易受外界主观因素的影响[6]。为了得到更精确的结果，目前常采用高效液相色谱[7]、气相质谱和色谱联用[8]、毛细管[9]和电感耦合等离子质谱[10]等分析技术结合化学计量学方法来进行定性、定量分析，所得试验结果精确，然而仪器操作过程复杂，分析时间长，不利于样品的快速分析。

离子迁移谱（IMS）是近年来发展起来的一种气相快速分离检测技术，其基本工作原理是通过气态离子的迁移率来表征各种不同的化学物质，以达到对各种物质分析检测的目的[11]。IMS 系统的核心部分是迁移管，迁移管分为电离区和迁移区2 部分，中间以离子门分隔开。样品由载气带入电离反应区后，载气分子和样品分子在离子源的作用下发生一系列电离反应，形成各种产物离子。在电场驱使下，离子通过周期性开启的离子门进入漂移区，与逆流的中性漂移气体分子不断碰撞并损失能量，产生各自不同的迁移速率，使得不同的离子到达探测器上的时间不同而得到分离。IMS技术以前大多应用于化学毒剂、毒品和爆炸物的分析检测，由于其应用领域的敏感性，有关IMS 报道较少[12]。近年来由于其具有无需样品前处理、耗时短和高灵敏度的优点，在国内外开始得到关注。研究人员发现由高灵敏度的IMS 技术和强分辨力的气相色谱（GC）技术结合形成的GC-IMS 技术，不仅可增强GC 的检测灵敏度，还可以提高IMS的分辨率和线性响应范围，是一项高灵敏度的检测技术。例如，葛含光等[13]采用气相色谱-离子迁移谱法检测出白酒中4种风味化合物的含量为正庚酸3.6 mg/L，正辛酸2.1 mg/L，己酸丁酯1.7 mg/L，月桂酸乙酯4.2 mg/L；Gallegos等[14]发现采用气相色谱-离子迁移谱法结合主成分分析能够有效识别并区分乳酸菌的4种菌株；Gerhardt等[15]采用GC-IMS 技术鉴定橄榄油产地，结果发现该方法能有效区分不同产地的橄榄油样品，并且成分复杂的样品也能获得高分辨率的三维指纹图谱。至今，将GC-IMS 技术应用于食品品质检测的报道并不多，更未见GC-IMS 技术应用于黄酒酒龄的快速检测。本文采用GC-IMS 技术并结合主成分分析鉴定黄酒不同酒龄及品牌，以期为黄酒的不同酒龄及产地检测提供一种快速精确的方法。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器

黄酒：1）同一品牌不同标注酒龄：3，5，8，10年和20年古越龙山；2）同一标注酒龄不同品牌：5年标注酒龄的古越龙山、塔牌和会稽山。所有黄酒样品均购自杭州沃尔玛超市。

仪器：Flavour SpecR气相色谱-离子迁移谱仪，德国GAS 公司。

1.2 样品处理

取1 mL 黄酒样品于20 mL 顶空进样瓶中密封，在室温条件下经顶空进样，采用气相离子迁移谱仪进行测定，每种样品重复测定3 次。

1.3 GC-IMS 条件

自动顶空进样器：进样体积100 μL，孵化时间20 min，孵化温度40 ℃，总分析时间为20 min。色谱柱：集成毛细管柱MCC-OV-5；载气/漂流气：高纯氮气（99.999%）；流速：2.0 mL/min；离子迁移管温度：40 ℃；进样器温度：80 ℃。

1.4 数据分析

黄酒的气相离子迁移谱采用LAV 2.000 进行分析。色度分析采用Photoshop 软件吸取指纹图中5 个已经鉴定成分的每个圆斑中心点和圆斑上下左右方向的半径中间点的颜色，取平均值。PCA 主成分分析和制图采用SPSS 18.0 和Origin 8.0 进行，显著性差异采用SPSS 18.0 分析。

2 结果与分析

2.1 黄酒气相离子迁移谱

图1 不同标注酒龄的古越龙山黄酒气相离子迁移谱对比图Fig.1 Ion mobility spectrum of Guyuelongshan Chinese rice wine samples of various marking age analyzed by GC-IMS

本试验采用GC-IMS 分析了不同标注酒龄及不同品牌黄酒的挥发性成分，结果如图1 和图2所示。图谱背景为蓝色，颜色越红代表该物质含量越高。GC-IMS 早期离子漂移时间1.0 ms 处的第1条红色竖线是水的反应离子峰（RIP），形成原因是顶空进样气体中含有水蒸气，IMS 放射性氚（3H）电离源产生的能量电子发生了气相反应，使质子化的水分子和氢离子聚集形成水分子。当挥发性化合物成分存在于IMS 的电离区域时，水的RIP强度就会降低或消失，这与Erickson等[16]报道一致。GC-IMS 早期离子漂移时间1.0 ms 处的第2条红色竖线是乙醇残留，由于黄酒中乙醇含量较大，并且试验所用色谱柱为SE54 弱极性色谱柱，导致乙醇在色谱柱中残留较多。由图1 和图2所示的挥发物分布情况可知，不同标注酒龄及品种的黄酒显示出不同的亮度。有些挥发物是以质子键合单体或二倍体形式出现的，Borsdorf等[17]详细解释了二聚体形成的原因。在没有进行物质定性前，无法确定GC-IMS 离子迁移图中可见的各斑点状化合物具体成分。

图2 不同品牌5年标注酒龄黄酒气相离子迁移谱对比图Fig.2 Ion mobility spectrum of 5-year marking age Chinese rice wine samples of different company brands analyzed by GC-IMS

2.2 黄酒样品挥发性有机物指纹图谱分析

根据现有的2014 NIST 数据库和IMS 数据库鉴定图谱中5种挥发性有机物，分别是二甲基二硫、乙酸乙酯、苯甲醛、乙酸异戊酯和丁酮。由图3可知，不同标注酒龄的古越龙山挥发性有机物中二甲基二硫和乙酸乙酯含量没有明显差异，而苯甲醛、乙酸异戊酯和丁酮含量有较大差异。8～20年黄酒的苯甲醛、乙酸异戊酯和丁酮含量远远高于3～5年黄酒，而8年和20年黄酒中苯甲醛、乙酸异戊酯和丁酮的含量差异较小，这些肉眼可见的差异可以快速判断3～5年与8～20年黄酒的年份差异。3～5年黄酒的25，28，29，30 号挥发性物质的含量远远高于8～20年黄酒，5年黄酒的6 号挥发性物质含量最高。3年黄酒的9 和10 号挥发性物质含量显著低于5～20年黄酒，3～5年黄酒的16，19，34，41 号挥发性物质含量与8～20年黄酒类似，肉眼观察不到显著差异。3～5年黄酒的1～5，7～9，11～14，17，18，20～22，24，26，27，31，33，35～39号挥发性物质含量远远少于8～20年黄酒，说明8～20年黄酒的挥发性物质含量明显高于3～5年黄酒。10年黄酒的部分挥发性物质含量明显少于8年和20年黄酒。一般酒龄越长，酒中挥发性物质积累越多。然而标注酒龄不同于真实酒龄，其以勾兑酒酒龄的加权平均计算，该10年黄酒所用勾兑酒可能与其它标注酒龄的黄酒不同。

由图4可知，3种品牌的黄酒中，乙酸乙酯含量相似，没有明显差异。二甲基二硫含量最高的黄酒为古越龙山；苯甲醛和丁酮含量最高的黄酒为塔牌，古越龙山均次之；乙酸异戊酯含量最高的黄酒为会稽山，其次是塔牌，这些差异可以快速判定不同品牌的5年标注酒龄黄酒。塔牌黄酒的1，3，13，15，17，18，20，22 ～24，26，31，32，40号挥发性物质含量最高；古越龙山的6，9，10 号挥发性物质的含量最高；会稽山的4，19，27，38，39 号挥发性物质的含量最高，3种黄酒的8，16，26，37，41 号挥发性物质的含量都高。而古越龙山的5，11，12，14，21，33，35，36 号挥发性物质的含量最少；塔牌的28，29 号挥发性物质的含量最少；会嵇山的2号挥发性物质的含量最少。以上说明5年塔牌黄酒的挥发性物质含量高于另外2种同龄黄酒。

图3 不同标注酒龄古越龙山黄酒挥发物指纹图谱Fig.3 Volatile organic compounds fingerprints of Guyuelongshan Chinese rice wine of various marking age analyzed by GC-IMS

2.3 黄酒样品5种挥发性有机物色度角分析

通过Photoshop 软件对GC-IMS 软件生成的指纹图谱进行色度角数值提取并做图，结果如图5所示。由图5a可知，8～20年古越龙山黄酒的苯甲醛、乙酸异戊酯和丁酮的H 值均很低，说明其含量很高，而3～5年黄酒的含量与之相反。3～5年黄酒的乙酸异戊酯和丁酮H 值在180～220 之间（青色和蓝色），而8～20年黄酒的乙酸异戊酯和丁酮H 值在20～72 之间（橙红色和黄色），区别非常明显。3年和5年黄酒苯甲醛的色度角数值有显著差异，3年黄酒的苯甲醛H 值为181.7（青蓝色），而5年黄酒的苯甲醛H 值为95.4（绿色），可以明显区分3年和5年黄酒，并且根据乙酸异戊酯H 值也可以区别3年和5年黄酒。8～20年黄酒的二甲基二硫和丁酮H 值分别处于16～42 和15～58（红色、橙色和黄色）范围内，说明其含量较高，并且20年黄酒的二甲基二硫和丁酮的H 值最低，分别为16.5 和15.6（红色），说明其含量最高，其次是8年黄酒。

由图5b可知，3种品牌黄酒中，塔牌黄酒的苯甲醛H 值最低为21.8（橙红色），其次是会稽山为55.1（黄色），而古越龙山的苯甲醛H 值最高为95.4（绿色）。塔牌的丁酮H 值最低为24.3（橙红色），会稽山和古越龙山的H 值分别为191.7（青蓝色）和181.2（青蓝色）。古越龙山的二甲基二硫的H 值为23.5（橙红色），低于塔牌的H 值47.7（橙黄色）和会稽山的H 值55.2（黄色）。会稽山的乙酸异戊酯H 值最低为32.2（橙红色），其次是塔牌的H 值61.1（黄绿色），古越龙山的H 值最高为195.6（青蓝色）。上述结果说明塔牌的苯甲醛和丁酮含量最高，古越龙山的二甲基二硫和会稽山的乙酸异戊酯含量高，3种黄酒的乙酸乙酯含量没有显著差异。

2.4 5种挥发性成分的信号峰强度变化

通过LAV 软件分析处理得到黄酒挥发性物质的信号峰强度值及相对强度值，如图6 和图7所示。由图6a可知，5种不同酒龄古越龙山黄酒的乙酸乙酯峰强度均最大，由于5年、8年和10年黄酒标准误差较大，所以3～20年黄酒的乙酸乙酯含量没有显著差异。20年黄酒的丁酮峰强度最大，8年黄酒的丁酮峰强度第二，8～20年黄酒的丁酮含量均显著高于3～5年黄酒，并且8年、10年和20年黄酒的丁酮含量呈现显著性差异。5种不同酒龄黄酒的二甲基二硫、苯甲醛和乙酸异戊酯峰强度均较小，说明古越龙山黄酒中这3种物质含量较少。3～20年黄酒的二甲基二硫含量没有显著性差异，8～20年黄酒的苯甲醛和乙酸异戊酯峰强度均显著高于3～5年黄酒。

由图6b可知，不同品牌黄酒中乙酸乙酯的峰强度均最高，相互之间没有显著差异。黄酒中含有较多的乙酸乙酯[18]，其次是丁酮。塔牌的丁酮含量显著高于古越龙山，而古越龙山的丁酮含量显著高于会稽山。不同品牌黄酒中二甲基二硫、苯甲醛和乙酸异戊酯峰强度均较小，并且3种酒的二甲基二硫峰强度差异较小。会稽山黄酒的乙酸异戊酯含量高于塔牌，而塔牌的乙酸异戊酯含量高于古越龙山。塔牌黄酒的苯甲醛峰强度最高，其次是古越龙山，会稽山最小。

由图7a可知，20年古越龙山黄酒中5种挥发性物质的相对峰强度都接近最高值，均在97%以上。8年黄酒次之，5种物质相对强度也都很高，均在85%以上。10年黄酒中5种物质相对峰强度稍低于8年黄酒，但5种物质也都很高，除乙酸异戊酯相对峰强度为68%，其它均在80%以上。3年和5年黄酒只有二甲基二硫和乙酸乙酯的相对峰强度很高，达到90%以上，而苯甲醛的相对峰强度分别62.3%和60%，乙酸异戊酯和丁酮相对峰强度均低于50%。不同酒龄黄酒的二甲基二硫和乙酸乙酯相对峰强度差异较小，而苯甲醛、乙酸异戊酯和丁酮有显著差异，这3种挥发性物质可用来快速检测不同龄的古越龙山黄酒。

由图7b可知，在不同品牌黄酒中，塔牌黄酒的5种挥发物中乙酸异戊酯相对峰强度较小为75.6%，会稽山黄酒的苯甲醛和丁酮相对峰强度较小，分别为44.7%和43.3%，古越龙山黄酒的苯甲醛和丁酮相对峰强度均为70.6%，乙酸异戊酯相对峰强度只有48.7%。3种黄酒的二甲基二硫和乙酸乙酯相对峰强度都较高，均达80%以上，且3种不同品牌的黄酒中苯甲醛、乙酸异戊酯和丁酮的相对峰强度差异较大，说明通过该方法能快速区分古越龙山、塔牌和会稽山黄酒。

图7 不同标注酒龄古越龙山黄酒和不同品牌5年标注酒龄黄酒的5种物质相对峰强度变化Fig.7 Changes of relative peak intensities of 5 substances on Guyuelongshan Chinese rice wine samples of various marking age and 5-year marking age Chinese rice wine samples of different company brands

2.5 不同品牌及酒龄黄酒挥发性物质的主成分分析

对5种标注酒龄的古越龙山黄酒和不同品牌的5年陈酿黄酒的强度数据进行主成分分析，以达到降维的目的。图8a是5种不同标注酒龄古越龙山黄酒的主成分二维得分图。由图8a可知，第1 主成分的分析值为71.88%，第2 主成分的分析值为14.19%，第1 主成分与第2 主成分之和为86.07%，表明PCA 第1、第2 主成分的结果可以代表GC-IMS 测定的各物质强度值对5种不同标注酒龄古越龙山黄酒的区分情况。由图8a可知，不同标注酒龄古越龙山黄酒能被很好的区分开来。

图8b是3种不同品牌的5年陈酿黄酒的主成分二维得分图，其第1 和第2 主成分贡献率分别为43.83%和28.55%，累计贡献率达72.38%。古越龙山、塔牌和会稽山5年标注酒龄黄酒在PCA图中能较好的区分，并且每个种类的集中性较好，说明PCA 分析具有较好的分类效果，能直观的鉴别不同品牌样品间的差异。

图8 不同标注酒龄古越龙山黄酒和不同品牌5年标注酒龄黄酒的主成分分析图Fig.8 PCA score plots of PC1 and PC2 of Guyuelongshan Chinese rice wine samples of various marking age and 5-year marking age Chinese rice wine samples of different company brands

3 结论

本试验研究建立了气相离子迁移谱快速鉴别不同品牌及标注酒龄黄酒的技术。通过离子迁移谱的挥发性有机物分析，发现苯甲醛、乙酸异戊酯和丁酮含量在不同品牌及标注酒龄的黄酒中差异较大，可作为快速检测黄酒的不同标注酒龄及品牌指标，并且利用PCA 分析能将不同品牌及标注酒龄黄酒较好的区分开来。该方便快捷操作简单快速、灵敏度高，结合化学计量学的分析方法，为我国市售黄酒标注酒龄及不同品牌的快速鉴定提供了一种新方法。