细菌素bifidocin A对凝固型发酵乳品质及贮藏性能的影响

邱 爽 宋 铮 张璟琳 王落琳，3 刘国荣* 孙宝国

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京市食品添加剂工程技术研究中心北京工商大学 北京100048 2 天津大学化工学院 天津300350 3 首都师范大学生命科学学院 北京100048）

酸奶是以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经过杀菌并接种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌（德氏乳杆菌保加利亚亚种）发酵等工艺而制成的一种乳制品。由于其具有营养丰富、风味独特且易于人体消化吸收等优点，所以深受大众喜爱。然而，酸奶在贮藏过程中会发生后酸化现象，即酸奶在结束正常发酵后，在贮存、运输、销售、饮用前等过程中，酸奶的菌体仍在不断繁殖，酸度持续上升，出现消费者难以接受的过酸味和感官品质的下降，进而影响酸奶的贮藏性能及跨地域销售[1-2]。

国内外研究学者广泛开展了酸奶弱酸化发酵菌株的筛选，这种优质菌株的筛选十分困难，现存的优质菌株大多掌握在国外企业机构手中，引入这些菌株会大大提高中国乳品企业的成本[3-5]。目前食品工业上普遍使用的防止酸奶后酸化的方法有发酵后二次加热处理[6]，发酵后快速冷却[2，6]，改变保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的比例[7]，添加乳酸链球菌素（nisin）[8]，添加葡萄糖氧化酶等[9-10]。发酵后快速冷却目的是使菌体的活力下降。改变保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的比例是通过增加发酵剂中球菌对杆菌的比例，使酸奶后发酵减弱。添加葡萄糖氧化酶是通过黑曲霉、点青霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，作为天然食品防腐剂除去食品中的氧，从而有效防止食品腐败。乳酸菌细菌素是乳酸菌代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对同种或亲缘较近的种有抑制作用的杀菌蛋白或多肽。其中，乳酸链球菌产生的乳链菌素已成功应用于食品工业控制酸奶后酸化。

动物双歧杆菌BB04可代谢合成新型广谱高效细菌素bifidocin A，是国内外首次报道的产细菌素的动物双歧杆菌[11]。课题组前期已建立bifidocin A 的提取纯化方法，分析了该细菌素的分子结构、生物学特性和抑菌机理，确定其有作为天然食品生物防腐剂的巨大应用潜力[12-14]。为探讨细菌素bifidocin A 在凝固型酸奶生产、加工及贮藏过程中的应用可行性，本研究以添加乳酸链球菌素为对照组，设置细菌素bifidocin A 的不同添加量（56，28，14 mg/mL）处理组，通过测定凝固型酸奶28 d 贮藏期内pH 值、可滴定酸度、持水力、活菌数、流变特性、质构性、挥发性风味物质等指标变化，分析比较细菌素bifidocin A 对产品品质及贮藏性能的影响，旨在为双歧杆菌细菌素的应用推广提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

商业凝固型酸奶发酵剂YC-350，丹麦科汉森股份有限公司；乳酸链球菌素，美国Sigma 公司（106IU/g）；MRS、MC 培养基，北京陆桥技术股份有限公司；细菌素bifidocin A 纯品（比活力5535 AU/mg，纯度95.3%），本实验室自主分离提取纯化[12]；巴氏杀菌奶、白砂糖，市售。

1.2 仪器与设备

MCR 102 流变仪，安东帕公司；TMS-pilot 质构仪，美国FTC 公司；905 滴定仪，Titrando 公司；H185 离心机，天林恒泰科技有限公司；pH400 pH计，安莱立思仪器科技有限公司；TSQ 8000 Evo气相色谱-质谱联用仪，赛默飞世尔科技公司。

1.3 酸奶的制备方法

1.3.1 酸奶的制备

1.3.2 试验设计与分组 试验共设计5 组处理，其中未添加任何细菌素且仅含有商业凝固型酸奶发酵剂YC-350 组为空白对照组；在混合发酵剂基础上添加终质量浓度50 mg/mL 乳酸链球菌素组为阳性对照组；在混合发酵剂基础上添加双歧杆菌细菌素bifidocin A 组为处理组。将处理组按添加量不同分为3 组：高添加量组，细菌素bifidocin A 终质量浓度为56 mg/mL；中添加量组，细菌素bifidocin A 终质量浓度为28 mg/mL；低添加量组，细菌素bifidocin A 终质量浓度为14 mg/mL。将制备的凝固型酸奶置于4 ℃贮藏，在贮藏第0，1，7，14，21，28 天分别检测样品的各项指标，主要包括：pH、可滴定酸度、持水力、活菌数、流变特性、质构性及挥发性风味物质含量。

1.4 凝固型酸奶指标测定方法

1.4.1 凝固型酸奶pH 值的测定 采用数显式pH计，在20 ℃室温下分别测定5 组样品的pH 值。

1.4.2 凝固型酸奶可滴定酸度的测定 采用酸度滴定仪测定酸度值，取8 g 样品加入适量去离子水作为待测样本，滴定液为1 mol/L 的NaOH 溶液，直接用滴定仪测滴定酸度。

1.4.3 凝固型酸奶持水力的测定 取适量后熟后的发酵乳，称重放入离心管中，以2 340 r/min 离心10 min，除去乳清后再次称重，按下式计算其持水力。

持水力（%）=离心后沉淀物质量（g）/样品质量（g）×100[15]

1.4.4 凝固型酸奶活菌数的测定 采用选择性培养基，通过菌落平板计数法测定活菌数。分别将5个处理组酸奶样品用生理盐水稀释到适当的梯度后倒入计数用无菌培养皿，用MRS 培养基测定保加利亚乳杆菌活菌数、用MC 培养基测定嗜热链球菌活菌数，37 ℃培养36 h，计数结果取对数。

1.4.5 凝固型酸奶流变特性的测定 将发酵乳按顺时针和逆时针分别搅拌10 圈后，取5 滴于流变仪检测平台上，选取直径40 mm 探头，控制温度为25 ℃。分析模式为：频率扫描，频率从0.01～10 Hz，用Herschel-Bulkley 模型进行拟合分析。

1.4.6 凝固型酸奶质构的测定 用质构仪进行TPA 分析。采用直径为50 mm 的柱形探头，探头下降速度90 cm/s，返回速度90 m/s，压缩距离10 mm，返回距离10 mm，触及力0.1 g。通过分析力获得硬度、内聚性、弹性、咀嚼性和黏附性、胶黏性6个TPA 参数。

1.4.7 凝固型酸奶挥发性风味物质的测定 取3 g 发酵乳样品置于15 mL 的顶空瓶中，加入3 mL饱和NaCl 溶液，加入10 μL 含有0.001%壬酸甲酯的甲醇溶液。在40 ℃条件下平衡10 min 后，用聚二甲硅氧烷（PDMS）纤维头萃取，40 ℃吸附40 min，GC 解析3 min，用于GC-MS 分析。

GC 条件为分流方式不分流。程序升温：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min 的速度升温至100 ℃，然后以10 ℃/min 的速度升温到220 ℃保持5 min。载气为氦气，体积流量为0.8 mL/min，进样口温度为250 ℃。

MS 条件为：EI 电离源，电子能量为70 eV，灯丝电流为0.20 mA，检测器350 V，扫描范围为30～450 amu，离子源温度为200 ℃。

2 结果与分析

2.1 凝固型酸奶贮藏过程中pH 值的变化

pH 值是评价发酵乳的重要指标之一，也是发酵乳制品口感和品质的重要影响因素。试验中，不同处理组酸奶在贮藏过程中pH 值变化情况如图1所示，可以看出，发酵过程中，乳酸菌利用乳品中的碳源产生乳酸，使pH 值下降。其中空白对照组在贮藏中pH 下降趋势明显，一般酸奶适口的pH 值为4.2～4.7，空白对照组pH 值达4.2 以下，后酸化较为严重。添加了细菌素的4 组处理组在贮藏中pH 值下降较为平缓，尤其以添加56 mg/mL bifidocin A 组下降最为平缓，最终pH 值均大于4.2。其中，添加28 mg/mL bifidocin A 组与添加50 mg/mL 乳酸链球菌素组在贮藏过程中pH 值下降趋势最为接近。

2.2 凝固型酸奶贮藏过程中可滴定酸度的变化

图2所示为不同处理组凝固型酸奶在贮藏过程中可滴定酸度变化情况。由图可知，凝固型酸奶在贮藏过程中，可滴定酸度均呈升高趋势，空白对照组上升最为迅速，根据GB 5413.34-2010《乳和乳制品酸度的测定》中规定发酵乳的酸度应>70°T[16-17]，最佳食用酸度为80～120°T[18-19]，空白对照组在第28 天时，酸度己超过120°T，后酸化现象十分严重。这是由于酸奶制品中残留的乳糖被活菌继续分解产酸，导致酸度持续上升。添加56 mg/mL bifidocin A 组可滴定酸度上升趋势最为平缓，添加28 mg/mL bifidocin A 组与添加50 mg/mL 乳酸链球菌素组可滴定酸度上升趋势最为接近，且在发酵28 d 后酸度仍符合最佳食用酸度标准。

图1 凝固型酸奶贮藏过程中pH 值的变化Fig.1 Changes of set yogurt on pH value during storage

图2 凝固型酸奶贮藏过程中可滴定酸度的变化Fig.2 Changes of set yogurt on titratable acidity during storage

2.3 凝固型酸奶贮藏过程中活菌数的变化

不同处理组酸奶在贮藏过程中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数变化情况分别如图3 和图4所示。由图3可知，发酵结束后，56 mg/mL bifidocin A 处理组保加利亚乳杆菌活菌数明显低于其它4 组处理，这可能是由于添加高质量浓度的细菌素严重影响了酸奶生产中保加利亚乳杆菌的增长所致；除56 mg/mL bifidocin A 处理组外，其它4 个处理组均表现较为类似的活菌数变化趋势，活菌数在发酵期间上升迅速，发酵完成后且贮藏7 d 内基本保持不变，之后逐渐减小（图3），这可能是贮藏前期酸奶中乳糖等营养物质含量丰富，乳酸菌活菌数量稳定或有所增长，随着贮藏时间的延长，乳酸菌因缺乏营养物质而逐渐衰亡，从而导致活菌数降低；通过比较不同处理组间活菌数变化，发现在发酵完成后空白对照组活菌数高于其它添加细菌素处理组，且在贮藏前期活菌数缓慢增长，说明细菌素的添加可不同程度抑制酸奶贮藏中乳酸菌的增长。值得关注的是：空白对照组在贮藏7 d 后出现了大幅下降，28 d 时活菌数达到2×108CFU/mL，而添加细菌素处理组活菌数下降缓慢，其中，添加28 mg/mL bifidocin A 组、添加14 mg/mL bifidocin A 组与添加50 mg/mL 乳酸链球菌素组在28 d 时活菌数都在5×108CFU/mL左右。总体来看，在贮藏前期空白对照组虽然活菌数较高，而在贮藏后期添加28 mg/mL bifidocin A组、添加14 mg/mL bifidocin A 组与添加50 mg/mL乳酸链球菌素组活菌数明显高于空白对照组。由图4可知，发酵结束后，嗜热链球菌活菌数略低于保加利亚乳杆菌，而在贮藏过程中变化的整体趋势与保加利亚乳杆菌基本一致。

2.4 凝固型酸奶贮藏过程中持水力的变化

图5所示为不同处理组凝固型酸奶在贮藏过程中持水力变化情况，由图可知，随着贮藏时间的延长，不同的处理组持水力指标均有下降，其中以空白对照组下降最为明显，在贮藏第28 天时持水力小于68%，严重影响了凝固型酸奶的口感，添加28 mg/mL bifidocin A 组的持水力变化最为缓慢，贮藏前后期持水力变化不大，添加28 mg/mL bifidocin A 组与50 mg/mL 乳酸链球菌素组持水力变化趋势最为接近，与添加14 mg/mL bifidocin A 组较为接近。

图3 凝固型酸奶贮藏过程中保加利亚乳杆菌活菌数的变化Fig.3 Changes of set yogurt on viable counts of Lactobacillus bulgaria during storage

图4 凝固型酸奶贮藏过程中嗜热链球菌活菌数的变化Fig.4 Changes of set yogurt on viable counts of Streptococcus thermophilus during storage

图5 凝固型酸奶贮藏过程中持水力的变化Fig.5 Changes of set yogurt on water holding capacity during storage

2.5 凝固型酸奶贮藏过程中流变参数的变化

试验中采用Hershel-Bulkley 模型分析了不同处理组酸乳的流变参数变化情况，结果见表1，可以看出，4种样品的相关系数均高于0.995，表明模型选择合理。

Herschel-Bulkley 模型公式为：

屈服应力τ0= τ-κr′n[20]

式中，τ——剪切应力，Pa；κ——稠度系数，Pa·sn；r′——剪切速率，s-1；n——流动特性指数。

流体的屈服应力是指对非牛顿流体施加的剪应力较小时流体只发生变形，不产生流动，当剪应力增大到临界值时流体才开始流动，此时的临界值剪应力称为该流体的屈服应力，用τ0表示。流动行为指数n 通过对比牛顿流体（n=1）的偏差程度，可以显示样品的流变学性质：当n＜1 时，样品为假塑性流体；当n>1 时，样品为胀塑性流体，发酵酸乳为非牛顿流体一假塑性流体[21]，n 值均小于1。表观黏度η300是指当剪切速率为300 s-1时样品的表观黏度。

贮藏过程中各组酸奶的屈服应力有先增大后减小的趋势，由于屈服应力值与硬度相关[22]，说明在贮藏过程中凝固型酸奶的硬度先增大后减小；从稠度系数和表观黏度来看，各组稠度系数变化不明显（P＞0.05），说明不同处理对凝固型酸奶剪切稀化的特性影响不大。贮藏过程中各组酸奶的表观黏度均有下降趋势，但各组之间表观黏度无明显差异（P＞0.05）。以上结果表明，添加细菌素未改变凝固型酸奶的流变学特性。

表1 贮藏过程中凝固型酸奶流变学参数的变化Table 1 Changes of set yogurt on rheological parameters during storage

（续表1）

2.6 凝固型酸奶贮藏过程中质构的变化

TPA 测定结果显示，在凝固型酸奶贮藏过程中，各个样品随着贮藏时间的延长，硬度、黏附性、胶黏性、咀嚼性有所增长，内聚性变化不大，各组样品之间无显著差异（P＞0.05）。以上结果表明，添加细菌素未改变凝固型酸奶的质构特性。

2.7 凝固型酸奶贮藏过程中挥发性风味物质的变化

表2～表4所示为不同处理组凝固型酸奶贮藏1，14，28 d 后挥发性物质种类和含量测定结果，可以看出，挥发性物质含量总体在14 d 时上升到较高数值，随后在28 d 下降。对于羰基化合物，检测出了3-羟基-2-丁酮、丙酮、2-庚酮、2-壬酮、2-戊酮、2-已酮，酸奶中酮类化合物一般是由不饱和脂肪酸与氨基酸的分解以及微生物的代谢生成的，3-羟基-2-丁酮、2-壬酮是奶香气味的主要来源[23]。发酵乳中检测到醇类物质有异辛醇、2-乙基己醇、二甲基丁醇、己二醇，且集中在贮藏28 d 后才检测出来。醇类物质一般由于糖类、氨基酸和醛类物质发生还原反应而产生。然而，因醇类物质的阈值较高，所以对发酵乳风味的影响较低[24]。发酵乳中检测到的酯类物质有乙酸乙酯、乙酸丁酯，其也在14 d 时含量较高，能够丰富发酵乳的口感。酸类物质能够使酸奶口感更为清爽，香气更加浓郁，是构成发酵乳特征风味的主要物质[25]。在样品中检测出戊酸、丙酸、丁酸、辛酸、己酸、羧酸。此外，还检测出苯与甲苯等芳香物质。对比同时期的不同处理组，添加56 mg/mL bifidocin A 组、添加28 mg/mL bifidocin A 组和添加50 mg/mL 乳酸链球菌素组中，有良好滋气味的挥发性化合物含量明显多于其它处理组（P<0.05）。

表2 凝固型酸奶贮藏1 d 后挥发性物质的种类Table 2 Types of set yogurt of volatile substances after storage for 1 d

（续表2）

表3 凝固型酸奶贮藏14 d 后挥发性物质的种类Table 3 Types of set yogurt of volatile substances after storage for 14 d

表4 凝固型酸奶贮藏28 d 后挥发性物质的种类Table 4 Types of set yogurt of volatile substances after storage for 28 d

（续表4）

3 结论

本研究在商业凝固型酸奶发酵剂基础上分别添加乳酸链球菌素和新型双歧杆菌细菌素bifidocin A，通过对比分析不同处理组贮藏28 d 过程中酸度、pH、持水力、活菌数的变化，以及影响品质指标中的持水力、质构性、流变特性及可挥发性风味物质变化，发现添加28 mg/mL bifidocin A 组与已被世界卫生组织认可的添加50 mg/mL 乳酸链球菌素组对凝固型酸奶后酸化的抑制效果最为相近，同时可确保酸奶保质期达到28 d，并明显改善凝固型酸奶的感官品质，提高其持水力和风味物质的保存量。基于以上研究结果，基本确定添加终浓度为28 mg/mL bifidocin A 到凝固型酸奶中可替代乳酸链球菌素，有效解决凝固型酸奶贮藏过程中后酸化的问题，并可在一定程度上改善酸奶的感官品质，显示出细菌素bifidocin A 作为新型天然食品生物防腐剂的巨大潜力。