具有醒酒活性的玉米肽的制备、富集和鉴定

赵谋明 马 梅 苏国万 郑 淋 刘 洋

（华南理工大学 广州510640）

饮酒是60 多种疾病的主要风险因素，在全球疾病主要风险因素中排名第三[1]。大量或慢性饮酒每年造成的死亡人数约占总死亡人数的5.9%（约330 万）[2]。面对如此高的酒精中毒死亡率，寻求有效的解酒护肝剂是人们的当务之急。

正常情况下，进入人体内的乙醇90%以上是在脱氢酶系统-乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）的催化作用下完成代谢的。肝脏中ADH活力水平是人体乙醇代谢的关键，提高其活性可加速乙醇在体内的代谢，促进醒酒[3-4]。郑连姬等[5]报道魔芋葡甘露聚糖可降低服用乙醇小鼠的血醇含量，通过提高ADH 活性加速酒精代谢，发挥其防醉解酒的作用。王洁[6]等研究发现中药葛根、葛花和枳椇子混合物可降低急性酒精中毒小鼠的血醇含量，并且其作用机制与提高肝脏ADH 活性有关。目前国内关于解酒药物的研究主要集中在传统中药的复方及初提物方面。

玉米黄粉是湿法生产玉米淀粉的主要副产物，其含有62%～74%的蛋白质，主要成分为醇溶蛋白（68%）、谷蛋白（22%）、球蛋白（1.2%）和白蛋白[7-8]。玉米黄粉蛋白质具有氨基酸组成不平衡、水溶性差的特点，限制了其在食品工业中的应用[9]。研究发现玉米黄粉经蛋白酶处理后，其水溶性可明显增加，并且水解物具有多种生理活性[10]，如降血压[11]，抗氧化[12-13]，护肝[14]，促进酒精代谢[15]等。其醒酒活性是1997年由日本学者Yamaguchi等[16]率先报道。郭辉[17]对玉米肽解酒机理研究发现，玉米肽在体外试验中能激活ADH，并指出玉米肽的醒酒机制与其激活ADH 有关。Ma[18]发现玉米混合肽和玉米纯肽均能提高ADH 活性，加速酒精代谢。刘鹏[19]采用双酶酶解玉米黄粉，得到的玉米肽对ADH 的激活率仅49.12%，蛋白质回收率也只有34%。

木瓜蛋白酶是由木瓜蛋白酶及木瓜凝乳蛋白酶等组成的多酶混合体系，兼具外切及内切作用。胰酶由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶等组成，所含的蛋白酶作用各有差异。其中，有的酶专一作用于特定的肽键，有的酶如羧肽酶和氨肽酶则可逐个水解蛋白肽链末端氨基酸残基，这些酶的共同作用能够高效催化蛋白质水解[19-20]。本试验在前期研究基础上，采用木瓜蛋白酶和胰酶双酶共同酶解玉米黄粉，优化酶解工艺，制备具有高醒酒活性的玉米肽，并对玉米肽中具有醒酒活性的成分分离、富集，以期开发出安全、高效的玉米醒酒肽。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米黄粉，肇庆焕发生物科技有限公司，粗蛋白含量为61.36%。

木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司；胰酶，广州华琪生物科技有限公司；乙醇脱氢酶（ADH，375 U/mg），美国Sigma 公司；ADH 测定试剂盒，南京建成生物科技有限公司有限公司；乙腈及甲醇等均为色谱纯级，美国Sigma 公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠等试剂，国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

VarioskanFLash 型酶标仪，美国Thermo 公司；KDH-2C 型定氮仪，上海纤检仪器有限公司；PHS-3C 型pH 计，上海雷磁精密仪器厂；Waters600 型高效液相色谱仪，美国 Waters 公司；1290 型超高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；maXis impact 型超高分辨飞行时间质谱仪，德国Bruker 公司；紫外可见分光光度计，尤尼科（上海）仪器有限责任公司；DFY-500 型摇摆式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司；SCIENTZ-12N 型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；H2050 型高速冷冻离心机，湖南湘仪集团；KDN-40 型消化炉，上海新嘉电子有限公司；SHA-C 型水浴摇床，常州澳华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米肽的制备及醒酒成分的富集工艺流程玉米黄粉→粉碎（过80 目筛）→加热处理→调pH 值→酶解→灭酶→离心取上清→冷冻干燥→玉米肽→80%醇沉→G15→冻干→高醒酒活性玉米肽。

1.3.2 木瓜蛋白酶和胰酶酶解条件的单因素试验设计

1.3.2.1 料液比对玉米黄粉蛋白质回收率和ADH激活率的影响 称取6 份玉米黄粉各10 g，分别按1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶15，1∶18 的料液比加入去离子水，于100 ℃加热30 min，冷却，调节pH 值至8.0。分别加入原料质量1%的木瓜蛋白酶和胰酶，于55 ℃酶解8 h，沸水浴10 min 灭酶，离心取上清，测定玉米黄粉蛋白质回收率和ADH 激活率。

1.3.2.2 酶添加量对玉米黄粉蛋白质回收率和ADH 激活率的影响 称取5 份玉米黄粉各10 g，分别加入100 mL 的去离子水，于100 ℃加热30 min，冷却，调节pH 值至8.0，分别加入总酶量为0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%的木瓜蛋白酶和胰酶，木瓜蛋白酶和胰酶添加量比为1∶1，于55 ℃酶解8 h，沸水浴10 min 灭酶，离心取上清，测定玉米黄粉蛋白质回收率和ADH 激活率。

1.3.2.3 酶配比对玉米黄粉蛋白质回收率和ADH激活率的影响 称取5 份玉米黄粉，分别加入100 mL 的去离子水，于100 ℃加热30 min，冷却，调节pH 值至8.0，总酶添加量为2%，分别加入酶配比为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3 的木瓜蛋白酶和胰酶，于55 ℃酶解8 h，沸水浴10 min 灭酶，离心取上清，测定玉米黄粉蛋白质回收率和ADH 激活率。

1.3.2.4 酶解时间对玉米黄粉蛋白质回收率和ADH 激活率的影响 称取6 份玉米蛋白粉，分别加入100 mL 的去离子水，于100 ℃加热30 min，冷却，调节pH 值至8.0，分别加入原料质量1%的木瓜蛋白酶和胰酶，于55 ℃分别酶解2，4，6，8，10，12 h，沸水浴10 min 灭酶，离心取上清，测定玉米黄粉蛋白质回收率和ADH 激活率。

1.3.3 不同体积分数的乙醇对玉米肽醒酒成分的分离富集 称取3 份玉米肽，按料液比1∶7 分别加入40%，60%，80%的乙醇，于室温下振荡30 min，收集上清和沉淀，蒸发浓缩水洗去除乙醇，测定ADH 激活率。

1.3.4 葡聚糖凝胶G-15 对玉米肽具有醒酒活性的成分的分离富集 取上述分离的样品配成100 mg/mL 的溶液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，上样量为1 mL，用去离子水洗脱，流速为1 mL/min。收集分离峰，测定ADH 激活率。

1.3.5 蛋白质含量测定 采用凯氏定氮法测定[19]，计算蛋白质回收率。

蛋白质回收率=（酶解液的蛋白质含量×上清液质量）/（原料的蛋白质含量×原料质量）×100%

1.3.6 ADH 激活率的测定 ADH 在有NAD+存在的弱碱性范围内，催化乙醇的脱氢生成乙醛的反应如下：

同时NAD+被还原成NADH（氧化型辅酶I）。NADH 在波长340 nm 处有一强吸收峰，通过测定波长340 nm 处NADH 吸光度每分钟的变化值，衡量ADH 的活力。

参考Xiao等[4]方法并稍作修改。将50 μL 质量浓度为0.5 mg/mL 的玉米肽溶液与150 μL 的工作液（乙醇脱氢酶测定试剂盒）混合，在37 ℃平衡5 min 后，通过添加50 μL 的ADH（2 U/mL）引发反应。使用多功能酶标仪于波长340 nm 处测定吸光度，每10 s 测定吸光度，连续测定10 min。使用试剂一（缓冲液）作阴性对照。绘制拟合反应曲线，并计算0 min 拟合曲线的一阶导数作为NADH 的增加速率，即初始反应速率。所有测定1 式3 份进行。ADH 活化率通过使用以下公式计算：

ADH 激活率=（Vs-Vo）/Vo×100%

式中，Vo——阴性对照的初始反应速率，AU/s；Vs——是测试样品的反应速率，AU/s。

1.3.7 分子质量分布的测定 采用高效液相色谱测定酶解液肽分子质量的分布情况。参考李露芳等[21]的方法。色谱条件如下：色谱柱采用TSK gel G200SWXL，流动相为0.1%三氟乙酸水溶液与乙腈按照8∶2 混合，检测波长为220 nm，流速1 mL/min，检测时间20 min，进样体积20 μL。标准肽样品：牛血清白蛋白（68 000 u）、马心细胞色素C（12 384 u）、抑肽酶（6511 u）、Gly-Gly-Gly（189 u），相对分子质量对数值与洗脱体积拟合直线方程为y=-1.7549x+13.842（R2=0.9937），其中，y 为标准肽分子质量对数，x 为洗脱体积。

1.3.8 UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 鉴定肽结构[22]

将富集到的组分溶于超纯水中，使其质量浓度为2 mg/mL，进样到在线连接RP-UPLC T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）的电喷雾质谱仪。进样量5 μL，流动相A 为水-甲酸（体积比1 000∶1），流动相B 为乙腈，所采用的梯度洗脱流程如下：0～1 min，0% B；1～9 min，0%～30.0% B（线性梯度）；9～10 min，30.0% B（等量洗脱）；10～13 min，30.0%～0% B（线性梯度）；13～15 min，0% B；流速：0.50 mL/min；检测波长：220 nm。样品以100 μL/min 的流速进入质谱仪，采用正离子扫描模式，雾化气和干燥气为高纯氮气，扫描范围为质/核比100～2 000 u。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶和胰酶酶解条件的优化

2.1.1 料液比对蛋白质回收率和ADH 激活率的影响 在酶解反应过程中，底物浓度是限制反应速度的关键因素。底物浓度太低，反应速度慢，且不经济；底物浓度过高，则部分底物不能溶解，影响传质[23]。由图1a可知，在木瓜蛋白酶和胰酶共同酶解下，玉米黄粉在不同料液比时的蛋白质回收率在59.14%～72.21%之间。当料液比从1∶18 提升到1∶6 时，底物浓度逐渐增加，蛋白质回收率呈现先上升后下降的趋势，在料液比为1∶12 时，达到最大值72.12%。料液比较低，蛋白质底物和酶分子浓度低，不利于酶分子与蛋白质分子有效接触。而随着料液比的提升，蛋白酶与底物蛋白质分子的接触几率增加，因此蛋白质回收率增加。当料液比继续提升，溶液较为黏稠，在搅拌状态下依然不利于酶催化速度及产物分子的扩散，从而对水解产生抑制作用，导致蛋白质回收率下降[24]。

由图1b可知，不同料液比时玉米肽的ADH激活率在52.89%～66.11%。随着料液比的提升，ADH 激活率呈先升高后下降的趋势，当料液比为1∶10，ADH 激活率达到最大值66.11%。结合蛋白质回收率和ADH 激活率综合考虑，选择1∶10 作为酶解反应最佳的料液比。

2.1.2 加酶量对蛋白质回收率和ADH 激活率的影响 由图2a可知，蛋白质回收率随着木瓜蛋白酶和胰酶总加酶量的增加而增大，这是因为蛋白酶用量增加，使得蛋白酶与蛋白质分子的接触机率增加，从而使蛋白质回收率呈现增加的趋势。当总加酶量增加到2.5%时，蛋白质回收率达到70.13%后基本不再变化，这可能是由于酶与底物之间达到过饱和状态，过饱和状态时酶之间会形成竞争关系，抑制其催化作用[25]。

由图2b可以看出，玉米肽对ADH 激活率在50.68%～66.52%。随着加酶量增加，ADH 激活率增加，当加酶量为2.5%，ADH 激活率达到最大值；当加酶量超过2.5%，ADH 激活率呈现下降趋势。加酶量为2%与2.5%时，蛋白质回收率相差很小，ADH 激活率没有显著性差异。出于经济成本考虑，选择2%作为最佳的加酶量。

图1 料液比对蛋白质回收率和ADH 激活率的影响Fig.1 Effects of liquid-to-material ratio on protein recovery ratio and ADH activation ratio

图2 加酶量对蛋白质回收率和ADH 激活率的影响Fig.2 Effects of quantity of enzyme on protein recovery ratio and ADH activation ratio

2.1.3 酶配比对蛋白质回收率和ADH 激活率的影响 由图3a可知，在总酶添加量确定的情况下，木瓜蛋白酶和胰酶比例由3∶1 变化到1∶3 时，蛋白质回收率为66.66%～69.29%，变化趋势不明显，故木瓜蛋白酶和胰酶的比例并不是影响蛋白质回收率的关键因素。当木瓜蛋白酶与胰酶按1∶1 的比例添加时，蛋白回收率略高。

由图3b可知，当木瓜蛋白酶和胰酶比例由3∶1 变化到1∶1，ADH 激活率呈增大的趋势；当胰酶与木瓜蛋白酶之间的比例超过1∶1 时，ADH 激活率之间无显著性差异。综合蛋白质回收率结果，选择木瓜蛋白酶与胰酶比为1∶1 作为最佳的酶配比。

2.1.4 酶解时间对蛋白质回收率和ADH 激活率的影响 由图4a可知，在木瓜蛋白酶和胰酶共同酶解条件下，当酶解时间由2 h 增加到8 h，蛋白质回收率呈增加的趋势，由52.64%增加到70.60%。当酶解时间超过8 h，蛋白质回收率的增加趋势趋于平缓，最终蛋白质回收率为72.35%。可能因为在酶解初期，底物蛋白质量比较大，酶活性高，产物少等有利因素使大量底物蛋白质被迅速水解为小分子肽，使得蛋白质回收率增加；酶解进行一段时间后，蛋白质回收率的上升趋势变缓，这是因为底物蛋白质含量逐步下降，产物逐渐增多，由于反馈抑制致使水解速度下降，从而使蛋白质回收率增加趋势变缓[26]。

由图4b可知，当酶解时间由2 h 增加到10 h，ADH 激活率由55.09%增加到65.28%，当酶解时间达到12 h，ADH 激活率下降到61.54%。酶解时间8 h 和10 h 的蛋白质回收率相差不大，ADH激活率无显著性差异。出于经济成本考虑，选择8 h 作为最佳酶解时间。

图3 酶配比对蛋白质回收率和ADH 激活率的影响Fig.3 Effects of enzyme ratio on protein recovery ratio and ADH activation ratio

图4 酶解时间对蛋白质回收率和ADH 激活率的影响Fig.4 Effects of hydrolysis time on protein recovery ratio and ADH activation ratio

2.2 不同体积分数乙醇分离富集的玉米肽对ADH 激活率的影响

由图5可知，采用40%，60%，80%乙醇分离富集玉米肽的上清液中ADH 的激活率依次为62.85%，56.74%，40.13%，呈下降趋势。原玉米肽的ADH 激活率为64.89%，高于不同体积分数乙醇分离的上清液的ADH 激活率。不同体积分数乙醇分离的沉淀中的ADH 的激活率依次为31.83%，36.45%，76.24%，呈上升趋势，其中80%乙醇分离的玉米肽沉淀的ADH 激活率达76.24%，显著高于原玉米肽，说明80%乙醇可以使具有高ADH 激活活性的玉米肽得到有效富集。

2.3 葡聚糖凝胶G-15 凝胶柱对玉米肽中醒酒成分的分离富集

由图6a可知，80%醇沉的玉米肽经过凝胶柱分离，得到4 个峰。由图6b可知，G1 和G2 组分的ADH 的激活率小于醇沉组分的ADH 激活率，而G3 和G4 的ADH 激活率大于醇沉组分的ADH激活率，其中G3 组分的激活率为78.36%，G4 组分的ADH 激活率为90.12%，与醇沉组分相比差异显著。说明用葡聚糖凝胶G-15 凝胶柱分离可使具有ADH 激活的玉米肽进一步得到富集。

图5 不同体积分数乙醇分离得到的玉米肽对ADH 激活的影响Fig.5 Effects of corn peptides isolated from different concentrations of ethanol on ADH activation ratio

由表1可知，葡聚糖凝胶G-15 凝胶柱分离的4 个组分分子质量大小不同，其中G1 和G2 中分子质量在1～3 ku 范围内的组分占主要部分，G3和G4 中分子质量<0.5 ku 的组分占主要部分，分别为72.76%和87.27%。G3 和G4 小于1 ku 的组分各占80.01%，91.02%，随着洗脱时间的推移，后面的峰中小分子质量组分所占的比例越来越大，这是因为凝胶色谱是依据溶质分子体积大小的差别，按照分子尺寸由大到小的顺序出峰，大的分子不能进入填料颗粒的内径，只能随流动相从填料颗粒的缝隙中直接流出柱子，所以先出峰，而小的分子可进入填料颗粒的内部，走的路径长，所以后出峰[27]。很多研究都发现小分子量的肽段具有更高的生物活性，并且更利于人体吸收[28-29]。

图6 玉米肽的葡聚糖凝胶G-15 凝胶柱分离及ADH 激活率测定Fig.6 Sephadex G-15 separation of corn peptide s and deter mination of ADH activation ratio

表1 葡聚糖凝胶G-15 凝胶柱分离组分的分子质量分布Table 1 Molecular weight distribution of separation components of sephadex G-15

表2 为葡聚糖凝胶G-15 凝胶柱分离的4 个组分的得率，其中G2 组分得率最大为47.79%，G3组分得率最小仅有3.25%，G4 组分得率为9.12%，4 个组分的得率与葡聚糖凝胶G-15 凝胶色谱图相对应。

2.4 玉米醒酒肽的结构鉴定

将G4 组分通过UPLI-MS/MS 进行结构鉴定。图7 和图8是G4 组分的基峰图（Base peak chromatogram，BPC）谱图及在波长220 nm 处的UV 谱图。G4 组分的UV 谱图在1.08 min 和4.26 min 处各有1 个主峰，而其它峰信号较微弱，经后续质谱鉴定这2 个峰分别为Tyr 及Trp。由于这2种氨基酸含有苯环，在紫外区有很强的吸收，从而会对其它在紫外区响应较弱的物质产生掩蔽效应。

表2 葡聚糖凝胶G-15 凝胶柱分离组分的得率Table 2 Yield distribution of separation components of sephadex G-15

图7 G4 组分的BPC 谱图Fig.7 Base peak chromatogram（BPC）of G4

图8 G4 组分在220 nm 处的紫外色谱图Fig.8 UV chromatogram at 220 nm of G4

搜索MASCOT 数据库，共得到6 条肽段，分别是 GQAIILP，GGTALPA，QAKGILP，YQQPIIGGA，VAAGGPA，VAVGGVP，上述肽段富含疏水性氨基酸（Ala，Leu，Ile，Pro，Tyr，Val），疏水性氨基酸所占比例为55.56%～71.43%。玉米肽中因富含疏水性氨基酸而表现出很好的抗氧化性，对乙醇代谢产生的大量氧自由基具有平衡作用[30]。此外，Yamaguchi[16]证明Leu 和Ala 有利于醒酒，它们通过稳定乙醇代谢所需的NAD+而加速酒精代谢。本文所鉴定的6 条肽都含有Ala，3 条肽含有Leu，所以这6 条肽段具有潜在的醒酒活性。王真真[31]也在玉米蛋白水解物中鉴定出相同的肽段Y-Q-QP-I-I-G-G-A。

3 结论

本研究通过单因素试验确定了最优酶解条件为：料液比1∶10、加酶量2%，木瓜蛋白酶和胰酶添加量比1∶1、酶解时间8 h，在此酶解条件下，蛋白质回收率为69.89%，ADH 激活率为65.72%。说明该方法能够用于制备具有醒酒活性的玉米肽。通过乙醇分离方法和凝胶柱层析法对玉米肽中具有醒酒活性的成分进行分离富集，得到具有高ADH 激活活性的G4 组分，其ADH 激活率达90.12%，较原酶解液提高24.4%。进一步将G4 组分通过UPLC-MS/MS 进行结构鉴定，然后通过搜索UniProt 数据库中的玉米蛋白库，得到6 条多肽。这6 条多肽具有潜在的醒酒活性，而这些肽段对ADH 的作用机理及构效关系还需进一步研究。本试验以玉米加工过程中的副产物玉米黄粉为原料，通过生物可控酶解技术制备具有醒酒活性玉米肽，反应条件温和、专一性强、全程可控和副产物少，不仅可以提高玉米蛋白高值化深加工利用，为保护环境做贡献，还能逐渐的满足人们对解酒产品的需求，使其在保健食品、药品上具有广泛应用的前景。