双蛋白营养干预促进肠-肝-脾轴免疫互作

王 靖 张婧婕 韩 迪 闫文杰 朱 宏 韩 娟 梁克红 仇 菊

（1 农业农村部食物与营养发展研究所 北京100081 2 北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心 北京100083）

白血病是常见的恶性肿瘤之一，发病以儿童和青年居多[1]。异基因造血干细胞移植（Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo -HSCT）是一种广泛应用于白血病患者的治疗方法，治愈率高。然而，患者移植后将会面临驾驭和管理宿主免疫状态极端变化的挑战。移植前需进行大剂量放、化疗和抗体介导的骨髓细胞清除过程，从而为移植进体内的造血干细胞提供空间。然而，随之而来的严重免疫缺陷、免疫重建延迟和并发症的发生，常常伴有生命危险，是移植相关疾病发生率和死亡率增加的重要因素[2-3]。移植后，供体免疫系统可以攻击受体或“宿主”，即移植物抗宿主病（Graft versus host disease，GVHD），是异基因造血干细胞移植的主要且常见的并发症，症状包括发热、肝脾肿大、腹泻、感染等，严重者可导致死亡[4]。如何促进免疫重建（预防感染等并发症和防止癌症复发），同时避免GVHD等并发症，是临床上亟需解决的课题。

1 器官免疫互作与肠-肝-脾轴（ILS Axis）

allo-HSCT 后的免疫重建和GVHD 的发生、发展都与免疫系统密切相关。目前研究显示，除了脾脏、胸腺、骨髓等免疫器官外，小肠、肝脏等组织作为非专职免疫器官，同样参与机体免疫调节。其中肝脏、肠道和脾脏之间存在紧密的免疫互作。

在胚胎学方面，肝脏在发育过程中直接从前肠出芽；出生后早期脾脏中发现的部分B 细胞来自胎肝。在解剖学和生理学方面，下肠系膜静脉主要收集大肠血液后注入脾静脉，然后和主要收集小肠血液的上肠系膜静脉汇合形成肝门静脉，进入肝脏；循环系统中的血液通过肝动脉进入肝脏；而肝总管与胆囊管汇合成胆总管，开口于十二指肠[5-6]。此外，肝脏、肠道、脾脏之间可通过体循环进行相互作用。

生物学功能方面，三者之间同样关系密切。首先，肠道微生物与宿主在肠道中以共生的方式存在，在消化中起重要作用，并且是黏膜免疫系统的一部分。正常情况下，除了小肠吸收的营养物质外，肠道中大量细菌的抗原和微生物产物可进入血液，随门静脉进入肝脏，调节肝脏免疫耐受。疾病状态下，微生物组成的变化或肠道通透性的改变会促进微生物易位到门脉循环中，导致微生物细胞壁成分（来自革兰氏阴性细菌的内毒素和来自真菌的β-葡聚糖）和DNA等产物通过血液输送到肝脏，被肝细胞上的免疫受体所识别，这些受体启动最终导致肝脏损伤的炎症级联反应[7]。肠道内定植细菌还会影响脾脏的发育成熟。新生儿肠道被广泛的细菌物种定植的过程，诱导了脾脏中胎肝来源B 细胞的快速增殖，同时伴随着脾脏边缘区（Marginal zone，MZ）B 细胞和IgM 浆细胞的快速发育，从而使得机体能够对病原体产生适应性免疫应答[8]。

肝脏是人体内脏里最大的器官，以代谢功能为主。肝脏富含各种常驻先天免疫细胞，包括自然杀伤（Natural killer，NK）细胞、枯否细胞（Kupffer cells，KCs）、淋巴细胞和树突细胞等。肝脏中的炎性巨噬细胞，占体内固定组织巨噬细胞总数的80%～90%。血浆脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）含量显著增加时，可通过刺激肝脏免疫细胞上的Toll 样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）引发全身炎症，从而引发其它先天免疫细胞快速募集到肝脏。此外，核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号传导还会导致肝组织内KCs 和巨噬细胞的活化，从而导致肝脏组织进一步受损[6]。恒定自然杀伤T（Invariant nature killer T，iNKT）细胞存在于肝脏内并且与许多肝脏疾病的发展有关，在被活化后，iNKT 细胞会导致肝损伤。肝脏功能异常会影响小肠功能[9]。从肝脏分泌到胆汁中的胆红素进入胆管系统并流入肠道进行排泄，在那里它被微生物分解代谢到肠腔中成为胆素。在对患非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的小鼠检测时发现，负责将胆汁酸转运到肝细胞中的溶质载体家族10 成员1（Slc10a1）和溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员Slco1a1 和Slco1b2 的表达被显著抑制，且胆汁酸与促炎细胞因子之间存在关联[10]。胆红素对尿胆酸的分解代谢可以调节肠道中的细菌的门或亚种。血清胆红素水平已显示与结直肠癌呈负相关[11]。肝脏功能异常同样会导致脾脏发生变化。肝硬化等晚期病例的脾脏体积增加，与门静脉压力梯度增加和门静脉高压症有关，同时脾脏肿大常见于脂肪肝等肝脏疾病患者[12]。进一步研究发现，肝硬化患者的脾肿大、纤维化和脾脏僵硬等症状与肝脏免疫紊乱有关，其机制主要是由于巨噬细胞受到干扰，并分泌促炎和促纤维化细胞因子[13]。

脾脏的主要功能是通过清除循环凋亡细胞和维持外周耐受，进而维持免疫稳态。脾脏的白髓区存在高水平的特化T 细胞和B 细胞，用于产生新的免疫细胞和抗体；并且它作为循环单核细胞的储库，能够被快速募集到各种炎症部位。脾脏能够产生大量促炎和抗炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白介素-6（Interleukin 6，IL-6）等，通过门静脉直接流入肝脏，从而增强肝脏中自然杀伤细胞活性[6]。脾脏同样参与肠道免疫调节。脾脏可充当免疫细胞储库，迁移到抗原入口的位点。体外抗原刺激后的抗原特异性脾IgM+B 细胞能够迁移到受体小鼠的肠中，主要转换为IgA+浆细胞。此外，口服霍乱病毒可促进小鼠脾B 细胞向肠内迁移，进而转换为IgA+浆细胞并增殖。去除肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes，mLN）会导致脾B 细胞更高水平活化[14]。

目前国际上把肠道和肝脏之间通过胆道、门静脉和体循环进行双向连接的交流称为 “肠-肝轴”（见图1），把肝脏与脾脏功能上的相互关联称为“肝-脾轴”（见图2）。当前研究显示，脾脏和肠道之间也存在着相互联系（见图3）。因此，作者团体提出，机体存在肠-肝-脾轴（Intestine-Liver-Spleen Axis，ILS Axis），通过肠道屏障（肠道微生态）免疫调节，肝脏维持免疫耐受，脾脏调节细胞免疫和体液免疫，即通过肠-肝-脾轴维持机体免疫稳态。

2 双蛋白促进allo-HSCT 患者免疫重建

2.1 allo-HSCT 移植后影响造血及免疫重建的因素

allo-HSCT 前大剂量放、化疗不仅严重损伤肠道、肝脏、脾脏等器官，而且患者的肠-肝-脾轴被破坏，加剧器官损伤和机体免疫紊乱。患者移植后面临造血重建和免疫重建，重建延迟则会造成患者免疫功能低下，感染风险增加，是移植相关疾病发生率和死亡率增加的重要因素[2-3]。

allo-HSCT 移植后造血重建依赖于供体造血干细胞的自我更新能力。炎症信号分子、肠道微生物群数量和种类的减少等因素会抑制造血干细胞增殖分化[2，17-19]。造血生长因子、抗细胞凋亡细胞因子和抗氧化剂可改善造血干细胞的增殖更新[20]。

图1 肠肝轴—肠和肝之间的双向交流Fig.1 Intestine-liver axis：bidirectional communication between the intestine and liver

图2 肝脾轴—肝脏和脾脏的双向交流Fig.2 Liver-spleen axis：bidirectional communication between liver and spleen

图3 肠道和脾脏的双向交流Fig.3 Two-way communication between the intestine and spleen

GVHD是免疫重建过程中主要且潜在的严重并发症，是影响T 细胞免疫重建的主要因素。急性GVHD 主要影响皮肤、肠道和肝脏，慢性GVHD 表现出与各种自身免疫疾病相似的多器官浸润[21]，延迟机体免疫重建，增加机体感染风险，严重影响患者的生活质量和生存期。肠道微生物变化和屏障功能损伤可通过TLR4等途径调节GVHD 诱导的炎症反应。破坏机体辅助性T 细胞17（Helper T cell 17，Th17）和FoxP3+CD4+调节性T细胞（Regulatory T cells，Tregs）的平衡，被认为在GVHD 的发生、发展中起重要作用[22-25]。Th17 细胞通过释放促炎因子IL-17 和TNF-α等，促进T 细胞激活和刺激上皮细胞、内皮细胞等多种细胞产生IL-6等炎性因子，诱发炎症反应，促进GVHD；Tregs 主要通过释放IL-10 和转化生长因子（Transforming growth factor β，TGF-β）抑制T 细胞和巨噬细胞的增殖活化，同时促进IgA等抗体分泌，抑制GVHD[26]。脾脏Tregs 细胞增加能够减轻GVHD[27]。临床研究显示，allo-HSCT 移植后患者IgA 水平经常降低数月，之后患者开始恢复正常的IgA 水平，然而，急性或慢性GVHD 患者仍然缺乏IgA[18]。研究显示，短期给药可通过减少机体内氧化应激降低肝脏中GVHD 相关细胞因子和趋化因子基因表达、循环IL-17 水平，减轻肝脏炎症和结肠溃疡，从而减轻急性GVHD[28]。

2.2 allo-HSCT 患者面临严重营养问题

受免疫重建和并发症等影响，allo-HSCT 患者消耗增大，营养需求比常人增加30%～50%。allo-HSCT 患者每天需补充1.5～2.0 g/kg 体重的蛋白质和至少146.5 kJ/kg 体重的卡路里来满足机体营养需求[29-30]。allo-HSCT 患者移植前及移植过程中身体质量指数（Body Mass Index，BMI）值低于正常水平的患者，即偏瘦患者，其生存率明显降低[31]。

虽然医疗工作者会对allo-HSCT 患者进行详细的营养评估和补充，但是高剂量放化疗及药物副作用等造成的严重胃肠道损伤会在很大程度上限制口服摄入，导致营养吸收不良；而且移植期间对患者饮食要求十分严格，稍有不慎会导致肠道感染甚至严重的GVHD。基于上述原因，患者经过异基因造血干细胞移植治疗后，会出现严重的蛋白质能量营养不良，严重影响生活质量及生存率[32]。allo-HSCT 患者营养问题成为移植过程中一大困境。

2.3 蛋白营养与机体免疫

当前研究显示，蛋白营养状况与机体免疫力密切相关。

1）蛋白营养不良会导致免疫细胞数量的显著下降，尤其是T 细胞的数量下降。小鼠饥饿8 h后胸腺细胞和脾细胞计数与正常摄食组相比显著下降。蛋白缺失饲料组小鼠与正常摄食组相比显示出脾萎缩和T 细胞数量下降[33]。人群试验显示出类似的结果。营养不良儿童与营养良好儿童相比，全血中CD4+和CD8+细胞数量显著降低[34]。

2）蛋白营养不良会降低感染病毒后免疫应答。小鼠在感染流感病毒时，低蛋白饲料组小鼠的病毒特异性抗体应答和流感核蛋白特异性CD8+T 细胞数量均显著低于蛋白充足饲料组小鼠。低蛋白饲料组小鼠感染流感病毒后病毒作用的持久性，迁移至肺部的炎症细胞种类和致死率等指标显著高于蛋白充足饲料组小鼠。将低蛋白饲料更换为蛋白充足饲料则能显著增加病毒清除率[35]。婴儿历什曼虫感染小鼠，蛋白营养不良会使促进T 细胞从胸腺迁移的分子功能失调[36-37]。

3）蛋白营养干预能够抑制炎症反应，提高机体免疫水平。膳食亮氨酸可影响幼年钝嘴鲷的血浆补体成分3（C3）、免疫球蛋白M（IgM）含量等血浆免疫参数，并通过调节IL-1β，白介素8（Interleukin 8，IL-8）来降低促炎因子的肝胰腺基因表达[38]。临床试验研究显示，癌症化疗患者给予乳清蛋白能够增加患者血清白蛋白和IgG 水平[39]。老年人的蛋白摄入推荐量是1.0～1.5 g/kg/d，然而多数老年人不能达到这个膳食蛋白摄入量，老年肌少症人群补充乳清蛋白和维生素D 能够减轻慢性低级炎症[40]。以上研究提示，可通过蛋白临床营养干预解决allo-HSCT 患者蛋白质营养不良问题。

2.4 双蛋白应用于allo-HSCT 患者临床营养干预

双蛋白是以大豆蛋白等植物蛋白和以牛奶蛋白等动物蛋白为代表的天然优质蛋白，按照量效关系和精准互作获得的食用蛋白源。2017年7月，国务院办公厅印发 《国民营养计划（2017—2030年）》，指出：针对不同人群的健康需求，着力发展双蛋白食物等新型营养健康食品。强化双蛋白工程等重大项目的实施力度。以优质动物蛋白、植物蛋白为主要营养基料，加大力度创新基础研究与加工技术工艺，开展双蛋白工程重点产品的转化推广。此外，双蛋白已纳入国家卫生健康委员会2019，2020年《国民营养计划》的重点工作。

前期动物功效评价实验显示，双蛋白在增加骨骼肌力量，促进支链氨基酸释放，增强抗疲劳能力等方面显著优于单一蛋白[41-44]。为解决allo-HSCT 患者蛋白质营养严重缺乏问题，从2016年3月开始，本研究团队与陆道培医院合作开展为期4年多的Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期双蛋白临床营养干预，双蛋白干预组样本量目前已达40 余例。采用随机对照研究方法进行双蛋白作用效果及机制研究，统计分析双蛋白干预组和未干预组患者干预前、后自身指标变化以及组间变化。I 期干预结果表明：在移植前给予双蛋白干预1.5 g/d，干预4 周后，双蛋白依从性良好的患者从移植后到出仓提前4～5 d；从出仓到出院提前10 d。对依从性良好的患者出院追踪3 个月，尚无患者因治疗需要返院。双蛋白营养干预在提高病床周转率和抗感染方面取得较显著成果。

进一步研究发现，双蛋白预干预可显著提高白血病患者的血清白蛋白、球蛋白和总蛋白含量，明显缓解患者蛋白质营养不良状况，提高肌肉水平，缩短平均植活时间，降低移植后感染发生率。此研究成果于2017年发表于Nutrition Research[45]。由此可见，血液病患者进行allo-HSCT 时，良好基础状态需要合理营养支持，是治疗顺利进行的重要前提。临床试验结果显示，双蛋白可以明显改善骨髓移植患者基础状态和生活质量，对降低感染等并发症的发生起到重要作用[31，45]。

3 双蛋白促进造血和免疫重建的潜在作用机制

本研究建立小鼠骨髓移植动物模型进行动物功效评价实验，并结合临床营养干预试验，对双蛋白促进造血、免疫重建的机制进行初步研究[41，45-47]。结果显示，双蛋白除提供氨基酸等营养素外，可通过与肠道、肝脏、脾脏等器官的协同作用改善机体营养状态，促进造血干细胞植入，加速造血重建和免疫重建，降低感染风险，减少GVHD等并发症发生率和死亡率。

图4 骨髓移植过程对肠-肝-脾轴的损伤和双蛋白对肠-肝-脾轴潜在作用机制图Fig.4 Injury of the bone marrow transplantation process on the intestine-liver-spleen axis and the potential mechanism of dual-protein on the intestine-liver-spleen axis

3.1 双蛋白促进免疫重建机制

由于大剂量放疗和抗生素等药物的大量使用，异基因造血干细胞移植的过程通常伴随肠道菌群失衡和多样性减少[46]。肠道菌群的多样性与移植后Tregs 数量、GVHD等并发症的发生率和死亡率呈负相关，肠球菌等肠道菌的相对丰度与之呈正相关[44]。收集双蛋白干预前、后allo-HSCT 患者大便，进行肠道菌群16S rDNA 测序及其组成分析，结果显示，双蛋白能够明显改善肠道菌群的组成，提高患者肠道菌群的多样性，降低肠球菌比例[47]，改善肠道屏障功能，减轻肠道炎症反应，减少炎症因子的生成和释放，降低GVHD等并发症的发生率。其次，动物模型显示，双蛋白与单一蛋白相比，能显著提高大鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）水平，进而增强机体抗氧化能力[41]，可改善放、化疗后氧化应激性肝脏损伤，促进肝脏的蛋白合成。临床试验显示，双蛋白显著改善allo-HSCT 患者肝脏功能，提高血清白蛋白水平[45]。此外，双蛋白显著促进骨髓移植小鼠外周血白细胞、红细胞、淋巴细胞数量恢复，增加脾脏NK 细胞、T 淋巴细胞和B 淋巴细胞数量，增强IgM等免疫球蛋白的分泌，促进脾脏恢复和免疫重建（另文发表）。

3.2 双蛋白与肠-肝-脾轴

根据当前试验结果，作者团队推测，双蛋白通过调节肠-肝-脾轴来促进allo-HSCT 后机体免疫重建（见图4）。双蛋白营养干预一方面通过抑制氧化应激反应，抑制肠道炎症反应和炎症因子分泌，抑制小肠细胞凋亡，保护肠道屏障功能，抑制肠道菌群易位和内毒素入血；另一方面双蛋白改善肠道微生态，增加有益菌的种类和数量，通过线粒体等途径增加Tregs 的数量和活性，促进IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子分泌，抑制Th17 细胞的活化，增强肠道的免疫耐受，抑制肠道GVHD反应。肠道功能改善可以减轻肝脏的炎症损伤和免疫激活，同时通过调节Tregs 和Th17 细胞比例改善脾脏功能，促进脾脏B 细胞发育成熟，向肠道聚集，并分泌IgA等抗体；肠道免疫耐受增强能够减少脾脏炎症因子的分泌，从而减少肝脏免疫系统的激活，减轻肝损伤，改善胆汁酸的分泌，维持肠道微生物的稳态，减轻GVHD，促进造血重建和T 细胞免疫重建，加速患者恢复。

4 结语

双蛋白食物作为新型营养健康食品，可明显改善allo-HSCT 患者基础状态及生存质量，缩短治疗时间，降低感染率和死亡率，减少医疗费用，干预效果显著。结合双蛋白动物功效评价实验和临床营养干预结果，作者团队首次提出机体可能存在“肠-肝-脾轴” 的免疫互作以及双蛋白调节肠-肝-脾轴促进免疫重建的潜在作用机制，目前正在开展进一步验证工作。