HPLC法测定活血壮筋丸中血竭素的含量测定

河南省许昌市食品药品检验检测中心（461000）潘彦荣 王爽 刘艳霞 常晓平

活血壮筋丸为常用的中成药，由制川乌、红花、血竭、乳香（去油）、没药（去油）、土鳖虫、地龙、全蝎、川牛膝、桂枝、人参等十一味药材组成，具有祛风活血，强腰壮筋的功效，用于筋骨疼痛，半身不遂等症状。根据本品的功能主治和处方组成，为了有效控制本品质量，选择处方中主药血竭的主要成分血竭素作为控制本品质量的指标成分。采用HPLC法对该药中的血竭素进行了含量测定研究。其方法简便、准确，重现性好，为本制剂质量控制提供了可靠的定量方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本岛津 UV2600Ⅱ型紫外分光检测器，沃特世e2695高效液相色谱仪，赛多利斯MSA225S-000-DU电子天平。

1.2 试药 血竭素（110811-201707）（中国药品生物制品鉴定研究院），活血壮筋丸供试样品（市场购买），乙腈（德国默克色谱纯），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

附图1 血竭素吸收光谱

附图2 1、血竭素吸收色谱，2、活血壮筋丸中血竭素吸收色谱，3、阴性色谱

2 方法与结果

2.1 色谱条件（避光操作） 测定波长的选择：取血竭素对照品溶液（33.5221μg/ml）和阴性对照溶液，在250～460nm进行扫描，结果对照品溶液光谱最大吸收峰分别位于270.0nm和440.0nm。参照《中国药典》[1]2015年版一部血竭的含量测定，选择440nm作为本品的测定波长。结果阴性对照无干扰见附图1。

附图3 血竭素吸收色谱

附图4 活血壮筋丸中血竭素吸收色谱

附图5 阴性色谱

附图6 1：江申柱；2：GL柱；3：Welch Materials柱；4：岛津150mm柱。

色谱柱：江申CenturySIL C18-EPS柱（250×4.6mm，5μm），乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液（50∶50）为流动相；柱温30℃；检测波长为440nm。在选定的色谱条件下，血竭素和样品中其他组分色谱峰可达到基线分离，血竭素与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数大于4000，见附图2。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取血竭素高氯酸盐对照品（中国药品生物制品检定所 批号110811-201707）11.54mg，置50ml的棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置25ml棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得（血竭素重量=血竭素高氯酸盐/1.377），制成每1ml含血竭素33.5221μg，见附图3。

2.3 样品溶液制备 取装量差异下的本品内容物约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入3%磷酸甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率360W，频率40kHz）10分钟，取出，放置至室温，再称定重量，用3%磷酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，即得，见附图4。

2.4 阴性对照液的制备 按照处方比例制备缺血竭的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液，见附图5。

2.5 检测限 用信噪比法测定，血竭素的检测限为3.3×10-4μg。

2.6 定量限 用信噪比法测定，血竭素的定量限为1.0×10-3μg。

2.7 线性考察 精密称取血竭素高氯酸盐对照品（血竭素重量=血竭素高氯酸盐/1.377），加3%磷酸甲醇溶液制成每1ml含血竭素33.5221μg的溶液，精密吸取对照品溶液各1、2、5、10、15、20μl，分别注入液相色谱仪，测定，结果见附表1。血竭素：线性范围33.5221～670.442ng；工作方程Y＝2182.622X-3811.553，γ=0.99998

2.8 精密度试验 精密吸取对照品溶液，连续测定6次，结果见附表2。结果表明，本方法精密度良好。

2.9 稳定性试验 取同一批号（批号：180101）供试品溶液，分别在第0、2、4、6、8、10、12小时进样1次，每次进样10μl，测定其峰面积，结果见附表3。结果表明，血竭素对照品溶液在12小时内稳定性良好。

2.10 提取完全性考察 原标准中血竭素高氯酸盐的测定方法中，样品提取采用的方法是振摇提取，参考相关研究资料[2-5]，且鉴于振摇提取受影响因素较多，误差较大，故采用超声提取作为供试品的提取方法。同时，对提取时间也进行了考察。考察了10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟五个不同提取时间，结果表明超声提取30分钟提取效率最高，故选择30分钟的提取时间，具体见附表4。

2.11 重复性试验 取样品（批号180101）分为三组，Ⅰ取样量约0.6g，Ⅱ取样量约1g，Ⅲ取样量约1.5g，每组分别称取6份，共计18份，按照上述含量测定方法测定血竭素含量，测定结果见附表5。

2.12 回收率试验 取已知含量的本品（批号180101，血竭素含量0.25mg/粒）内容物约1g，精密称定，称取6份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入血竭素高氯酸盐3%磷酸甲醇溶液（14.9964μg/ml）25ml，称定重量，超声处理（功率360W 频率40kHz）30分钟，取出，放置至室温，再称定重量，用3%磷酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，照正文含量测定项下的方法测定血竭素含量，计算回收率，结果见附表6。

2.13 样品测定 本品5批，按照正文含量测定项下的方法测定血竭素含量，结果见附表7。

2.14 不同商品规格的色谱柱试验 考察了四根不同商品规格的色谱柱(色谱柱：①江申：CenturySIL C18-EPS柱（250×4.6mm，5μm）；②GL Sciences：Wonda Sil C18柱（4.6×250mm，5μm）；③Welch Materials：Ultimate XB-C18柱（250×4.6mm，5μm）；④岛津：Shimpack VP-ODS柱（150×4.6mm，5μm）)，分别测定同一对照品溶液和同一供试品溶液（批号180101），具体结果见附表8，图谱见附图6。

附表1 线性关系考察

附表2 精密度试验

附表3 稳定性试验

附表4 提取方法选择

附表5 重复性测定结果

附表6 回收率试验

附表7 样品含量测定结果

附表8 不同商品规格的色谱柱测定结果

3 讨论

3.1 波长的选择 选用紫外分光光度法（UV）在波长250～460nm对血竭素对照品溶液进行扫描，对照品溶液在位于270.0nm和440.0nm有最大吸收。参照《中国药典》2015年版一部血竭的含量测定，故采用该波长440nm为高效液相色谱法的检测波长。

3.2 色谱柱的选择 为了考察活血壮筋丸血竭素含量测定方法中不同色谱柱中的稳定性，选择了四根不同商品规格的色谱柱，分别对同一对照品溶液和同一供试品溶液进行测试，测试结果RSD≤2%，证明该方法的可行性、科学性、先进性。

3.3 抗干扰 通过查阅相关资料进行方法验证[6][7][8]，经过反复试验，用上述试验结果充分证明该方法耐用性试验良好。血竭素峰理论板数参照《中国药典》2015年版一部血竭含量测定项下规定，不得低于4000。为了考察干扰组分的干扰情况，分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照液各10μl，注入色谱仪。记录色谱图，结果供试品色谱中，在与对照品色谱相同保留时间有对应的峰，阴性对照液无对应峰。在本次实验过程中，本着节能环保的理念。既要保证药品质量，又要保证该方法的可行性，故采用此方法。