紫娟茶树bHLH转录因子MYC1基因克隆及表达分析

曲 浩，刘 悦，孙云南，尚卫琼，田易萍，陈林波

（云南省农业科学院茶叶研究所，云南省茶学重点实验室，云南勐海666201）

紫娟茶树（Camellia sinensiscv.Zijuan）具有紫色新梢、紫色嫩叶等特征，其中含有大量花青素，具有很好的保健作用[1]。但是紫娟茶树在不同区域种植会发生新梢、嫩叶变绿现象，从而影响茶叶的品质[2]。紫娟芽叶色泽呈现紫色和高含量花青素是评价其茶叶品质的重要指标。研究发现[2]，紫娟叶片发育成熟后颜色由紫变绿，原因可能是由于花青素等内含物质发生了变化；有研究表明，结构基因决定花青素苷的种类，而调控基因编码的转录因子决定结构基因表达与否及强弱，影响花青素合成的量[3-4]。

目前，已从紫葡萄、紫红薯、越橘等植物中分离克隆了大量与花青素合成代谢相关的结构基因与调控基因[5-7]。bHLH转录因子功能涉及黄酮类生物合成、花器官形成及表皮细胞的形成[8-10]。有研究发现，苹果中bHLH蛋白MdbHLH3和MdbHLH33是R2R3-MYB类转录因子，MdMYB10有效诱导花青素合成蛋白依赖于MdbHLH3和MdbHLH33的共同表达[11]；在玉米中，bHLH蛋白与MYB转录因子C1、PL1协作参与调控花青素合成信号通路[12]。MYC1基因是bHLH家族中的重要成员，目前的研究表明，MYC1基因在葡萄中参与类黄酮类化合物的调控[8]。此外，MYC1基因参与了花青素的调节与原花青素的生物合成，能够与不同的MYB转录因子协同调控花青素合成信号通路[13]。

本研究基于前期对紫娟茶树的转录组测序，发现了MYC1基因在叶片中的表达差异，对MYC1基因进行克隆得到其完整序列，采用生物信息学软件对19个MYC1同源基因进行进化树的构建，并对紫娟MYC1与葡萄vvMYC1氨基酸序列进行比对分析；此外，采用实时荧光定量PCR对不同光质照射下及不同空间生长的紫娟叶片中MYC1基因进行检测，以明确MYC1基因的生物学功能和表达特性，为进一步研究MYC1基因对花青素合成的调控机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料选用云南省农业科学院茶叶研究所培育的紫娟茶树叶片。基因克隆试验材料选取第二叶进行；不同光质照射实时荧光定量PCR分析选取第二叶为材料；基因空间表达实时荧光定量PCR分析选取芽、第二叶、开面叶、成熟叶为材料。采集的样品于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 紫娟茶树MYC1基因的克隆 根据获得的MYC1基因片段序列信息，采用DNAstar软件设计引物；采用RACE方法对MYC1基因片段3′端和5′端进行克隆，拼接验证后获得全长cDNA。

1.2.2 生物信息学分析 在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上完成核苷酸和蛋白序列比对分析；用Protparam工具进行基因编码蛋白理化性质分析；采用SignalP预测氨基酸序列信号肽；采用ProtScale进行亲水性分析；采用ProtCompv.9.0进行亚细胞定位分析；采用MEGA7软件进行MYC1相关基因进化树的构建；利用SWISS-MoDEL预测蛋白质三维结构。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测 用自然光、绿光、蓝光、黄光、紫光分别处理紫娟茶树，并采集芽、第二叶、开面叶、成熟叶，采用植物总RNA抽提纯化试剂盒提取RNA，以反转录后所得的cDNA为模板，GAPDH作为内参基因，采用SYBR法进行实时荧光定量PCR检测。GAPDH所用引物序列为GAPDH-F：5′-GATAGTGTTCACGGTCAATGGA-3′和 GAPDH-R：5′-TATCCTTATCAGTGAAGACACC AGT-3′；MYC1所用引物为 MYC1-F1：5′-TCTTTC CCTCCTGGTGTTGG-3′和 MYC1-R1：5′-GCACTCT TGGCGAGAATAGCT-3′。

2 结果与分析

2.1 MYC1基因的克隆

以紫娟茶树叶片的基因组DNA为模板，克隆获得紫娟茶树MYC1基因的全长为2 576 bp，其中，A碱基657个，占25.5%；G碱基677个，占26.28%；C碱基653个，占25.35%；T碱基589个，占22.86%。研究还发现，常见的酶切位点222个，另外，MYC1基因包含一个2 307 bp的完整开放阅读框（ORF），编码768个氨基酸，蛋白质理论分子量为85.26 ku，理论等电点为4.63；预测分子式为C3752H5938N1062O1180S23，原子总数为11 955，脂溶系数78，不稳定系数66.44，属于不稳定蛋白质（图1）。

2.2 MYC1基因生物信息学分析

2.2.1 进化树分析 选取15个不同物种MYC1和3个茶树bHLH家族基因的核苷酸序列与紫娟MYC1的核苷酸序列进行同源比对分析，并利用MEGA7软件构建进化树，结果表明，它们都属于IIIf亚类，紫娟茶树MYC1与葡萄vvMYC1、茶树bHLH1、茶树MYC2以及番茄SIMYC1具有较高的同源性（图 2）。

2.2.2 蛋白疏水性分析及信号肽预测 将推测的氨基酸序列导入ProtScale工具进行蛋白一级结构的亲/疏水性预测，结果表明，最高正值2.911出现在第713位氨基酸，疏水性最强；最小负值-3.5出现在第305—313位氨基酸，亲水性最强（图3-A）；其平均疏水性系数为-0.519，MYC1属于不稳定亲水蛋白质（负值为亲水、正值为疏水）。信号肽预测结果显示（图3-B），信号肽预测值为0.010 3，其他预测值为0.989 7，因此，MYC1蛋白不含有信号肽，没有信号识别功能，为非分泌蛋白。

2.2.3 蛋白亚细胞定位预测 蛋白亚细胞预测分析结果显示，蛋白定位的整体预测中细胞核得分为9.97，说明该蛋白大概率定位在细胞核（表1）。

表1 MYC1蛋白亚细胞定位预测

2.2.4 氨基酸序列比对 将推导出的茶树MYC1的氨基酸序列与葡萄vvMYC1、茶树bHLH1的氨基酸序列进行比对，结果显示，它们的序列具有一定的相似性，MYC1、vvMYC1和bHLH1的氨基酸序列在N端都含有一个保守的MYB互作区域。此外，在MYC1和vvMYC1氨基酸序列MYB互作区域的N端发现了一个富含酸性氨基酸的序列，该序列包含29个酸性氨基酸（图4）。这个MYB互作区域通常被认为是反激活域，它形成了一个蛋白结合表面，与RNA聚合酶Ⅱ启动转录[14]。

2.2.5 蛋白的三维结构预测 利用SWISS-MODEL构建紫娟茶树MYC1蛋白的三维结构模型（图5-A），MYC1蛋白三维结构与模板结构相似度为32.78%；图5-B中，深色为完全允许区域，散点大多集中在深色区域，表明MYC1蛋白三维结构预测结果较为可靠。

2.3 MYC1基因表达分析

2.3.1MYC1基因在紫娟茶树叶片中的时空表达分析 采集紫娟茶树芽、第二叶、开面叶、成熟叶分别进行实时荧光定量PCR检测MYC1基因的表达情况，结果表明，第二叶中MYC1基因表达量最高，是芽中MYC1基因表达量的2.2倍；开面叶中MYC1基因的表达量低于第二叶，是芽中的1.8倍；成熟叶中MYC1基因表达量最低，为芽中的0.56倍（图 6）。

2.3.2MYC1基因在不同光质下的表达 将紫娟茶树分别放置在室温下，在自然光、紫光、绿光、蓝光、黄光照射下培养，使用实时荧光定量PCR技术检测MYC1基因的表达情况，结果表明，在不同光质照射下，自然光下MYC1基因表达量最高，黄光下MYC1基因表达量最低，其他光质下MYC1基因表达量大小顺序为紫光＞绿光＞蓝光（图7）。

3 结论与讨论

本研究获取了紫娟茶树MYC1的全长，选取了15个物种MYC1和3个茶树bHLH家族基因构建进化树[14]，结果发现，它们都属于IIIf亚类，并且与葡萄vvMYC1、番茄SIMYC1具有较高的同源性。前人研究表明，MYC1参与了类黄酮生物合成的调控。在葡萄中，类黄酮通路基因的调控依赖于MYB转录因子与其相互作用[15]。本研究发现，紫娟MYC1与葡萄vvMYC1氨基酸序列在N端都含有一个保守的MYB互作区域，表明紫娟MYC1基因可能同样参与类黄酮生物合成的调控，并且发挥着与葡萄vvMYC1基因相同的作用。

花青素是一类广泛存在于植物中的类黄酮化合物，对调节叶片颜色起着重要的作用[16]。已有研究表明，紫娟茶树叶片花青素含量由高到低分别为第二叶、开面叶、芽、成熟叶[2]。本研究发现，MYC1基因在紫娟叶片中的表达量由高到低同样为第二叶、开面叶、芽、成熟叶。说明在紫娟茶树中，MYC1基因可能参与调节花青素的生物合成。此外，前人研究还表明[17-18]，不同光质的照射能够对茶树花青素含量造成影响。在苹果中，光诱导MYB基因表达调控红苹果花青素的生物合成[19]。本试验表明，在黄、绿、蓝、紫这4种光质照射下，紫光中MYC1表达量最高，说明不同光质对MYC1基因表达造成了一定影响。推测光质通过对MYC1基因的应答来调控花青素的含量，从而调节叶片颜色，但其作用机制还有待进一步研究。基于上述分析，初步推测MYC1基因参与了紫娟茶树花青素的生物合成，并且紫娟MYC1基因的表达与光质有关。