鲫鱼籽唾液酸糖蛋白的N-糖链结构及生物活性

王 宁,杨泽林,吴剑荣,詹晓北

(江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122)

真核生物的蛋白质糖基化是一种普遍的翻译后修饰，在生命活动和结构功能关系中发挥重要作用。糖基化不仅影响蛋白质在细胞内的折叠、运输、定位等行为，而且通过糖-蛋白间特异性识别机制调节生物体内受体激活、信号转导等许多重要生物学进程[1]。唾液酸是一类九碳酮糖酸的总称，为神经氨酸衍生物，其中5-N-乙酰-神经氨酸(NeuAc)是自然界存在最广泛的唾液酸。在脊椎动物中，唾液酸存在于细胞表面复合糖链末端，主要以糖蛋白或糖脂形式存在[2]。由于其独特的位置特点和结构特性，唾液酸参与调节大量生理及病理进程，例如在一些癌症细胞中，唾液酸往往过量表达[3]。在受精过程中，唾液酸也在卵细胞与精子结合过程中扮演着重要作用[4]。此外，在一些特殊细胞表面还有聚唾液酸，主要存在于新生婴儿、精子和部分肿瘤细胞上[5]。

唾液酸糖蛋白(SGP)是指一类富含唾液酸的糖蛋白，大部分含有分支型、复杂型的末端唾液酸化的寡糖链。SGP具有良好的抗结合作用，主要表现为抑制细菌及病毒与宿主细胞之间结合[6]，包括抑制沙门氏菌等病原菌，并能与A型流感病毒血凝素相结合。另外，SGP的唾液酸寡糖还参与机体内的生物合成代谢反应。因此，SGP及其衍生物有望作为良好、安全的预防类药物或功能食品，用于防止细菌或病毒感染。

富含唾液酸的糖蛋白在脑、神经组织、血液、颌下腺、黏蛋白、初乳、精子以及部分癌细胞中存在较多，但是其含量低，纯化制备困难。比较典型的富含唾液酸糖蛋白的来源是燕窝，其唾液酸含量最高，根据产地不同，唾液酸含量为8%～15%(质量分数)。燕窝糖蛋白上70%的糖链以三天线或四天线的寡糖链形式存在，末端唾液酸以α2-3糖苷键连接在半乳糖基上[7]。另外也有研究从鸡蛋中提取SGP，发现其唾液酸量为24～29 mg/kg，主连接键主要是α2-6糖苷键[8-9]。此外，周晓春[10]发现鲫鱼籽中唾液酸含量为2.4%，从鲫鱼籽中提取唾液酸糖蛋白的唾液酸含量高可达5.9%，该唾液酸糖蛋白可以显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的作用，可用于开发抗骨质疏松食品等[11]。陈璇[12]从猪小肠黏膜肝素加工废弃物中提取高含唾液酸糖蛋白，结构分析表明糖蛋白为O-糖链修饰、高唾液酸化、GlcNAc C-6位硫酸根取代、抗原表位主要为Blood group H型的黏蛋白。

鲫鱼在我国淡水鱼消费量排名中名列第五，但是其鱼籽常常丢弃，未能资源化利用。本研究中，笔者从唾液酸含量较高的鲫鱼籽中提取和纯化唾液酸糖蛋白，并对其N-糖链结构和生物活性进行研究，以期对其进一步资源化利用提供指导。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

SDS-PAGE相关试剂及考马斯亮蓝R-250，Bio-Rad公司；Q Sepharose Fast Flow(QFF)色谱柱，GE Healthcare公司；其他常规化学试剂，国药集团化学试剂有限公司。鲫鱼籽从市场上新鲜购买，剔除系带和鱼泡后冷冻保存待用。

1.2 鲫鱼籽中粗糖蛋白的提取和纯化

将成熟的鲫鱼籽(300 g)加入900 mL(液料比为3∶ 1)的0.5 mol/L NaCl溶液，用高速分散机均质10 min，并在3 000g离心5 min后除去残余物。将上清液与等体积的90%苯酚混合，并将混合物在4 ℃下搅拌过夜。在3 000g离心10 min后，将水相倾析到截留分子量为3 000的透析袋中，用自来水透析3 d，然后用蒸馏水透析1 d以除去苯酚，冷冻干燥后获得粗糖蛋白。

粗糖蛋白进一步用QFF离子交换层析柱(用0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液预平衡，pH 8.2)进行纯化，用含NaCl(0～1 mol/L)的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱。洗脱曲线由蛋白质在280 nm处检测吸光度，唾液酸可进一步采用间苯二酚方法测定[13]，己糖采用苯酚-硫酸方法测定[14]。收集含有唾液酸收集液，冻干并命名为CcSGP。

1.3 SDS-PAGE分析及PAS染色

糖蛋白样品用含有100 g/Lβ-巯基乙醇的上样缓冲液在100 ℃水浴下变性5 min，并通过SDS-PAGE用100 g/L溶解凝胶和50 g/L堆积凝胶在80 V下分级分离30 min，然后在100 V下持续1 h。每种样品加载的蛋白质量约为50 μg。将凝胶用CBB R-250进行染色，并经常更换固定溶液(体积分数30%乙醇，体积分数10%乙酸)，直到过量的污渍消失为止。电泳后用高碘酸-希夫(PAS)进行初次染色。电泳后，将凝胶浸入体积分数12.5%三氯乙酸中20 min，然后在黑暗中浸泡10 g/L高碘酸25 min。然后将其浸入希夫品红-亚硫酸盐试剂中在黑暗中处理15 min，再用5 g/L的硫酸二甲酯中洗涤2次，然后在水中洗涤直至凝胶脱色并拍照分析。

1.4 鲫鱼籽糖蛋白N-糖链的释放和质谱分析

在10 μL反应体系中，加入1～20 μg纯化的糖蛋白，加入1 μL 10×糖蛋白变性缓冲液(含0.5%SDS，400 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)和去离子水(如果需要))。然后在100 ℃煮沸处10 min，使糖蛋白变性。再加入2 μL 10×GlycoBuffer 2缓冲液，2 μL 10%(质量分数)乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，1～2 μL的肽N-糖苷酶F(PNGase F)，加水至20 μL，在37 ℃温育1 h进行N-糖链释放。

进一步采用C18小柱吸附样品中蛋白质，使糖链与蛋白质得到分离。首先用10 mL乙腈活化C18柱，用20 mL纯水平衡柱子，将准备好的含糖链样品加样于C18柱，用10 mL水平衡C18柱，得到含糖链馏分，冻干备用。再用SPE-石墨化碳(1 000 mg，Acchrom公司)小柱进行糖链吸附：先用10 mL乙腈活化石墨化碳填料，再用20 mL水平衡柱子，将糖链馏分配制适合浓度进行上样，采用不同浓度梯度的乙腈水溶液(5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%和50%)进行洗脱，并对洗脱馏分进行收集检验。

将上述收集的含糖链馏分采用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)进行分析(Ultrafle Xtreme型,Bruker Daltonics公司)。N-糖链样品水溶液质量浓度约为0.1 mg/mL，吸取样液1 μL加到样品板上，室温下晾干，等样品板上的液体全部挥发后，加入1 μL 2,5-二羟基苯甲酸(DHB)基质,室温下晾干，样品与基质混合结晶后进行分析。

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1.5 DPPH自由基清除

取1.0 mL不同质量浓度(2～10 mg/mL)糖蛋白样品溶液和3.0 mL DPPH溶液(0.05 mmol/L甲醇溶液)。摇匀混合物，放置在黑暗的房间中30 min，然后在517 nm处测量吸光度。以抗坏血酸作为对照，DPPH自由基的清除作用按式(1)计算。

(1)

式中：A0为不含样品的·DPPH的吸光度，A1是·DPPH和样品的吸光度，A2为不含·DPPH的样品吸光度。

1.6 阻止磷酸钙沉淀实验

采用pH-Stat法检测唾液酸糖蛋白对磷酸钙沉淀的抑制效果。配制唾液酸糖蛋白溶液，使质量浓度为0、0.1和0.2 g/L。配制酪蛋白磷酸肽(CPP)溶液，使质量浓度为0.1 g/L。取上述配制的溶液各200 mL，分别加入NaH2PO4和CaCl2，使NaH2PO4和CaCl2的浓度均为0.008 mol/L。待溶解后立即用0.1 mol/L NaOH溶液调节反应液的pH至7.2，这段时间为2 min，并不断滴加NaOH 溶液使pH保持在7.2。记录不同时刻NaOH 溶液的消耗量，并以时间为横坐标，NaOH溶液消耗量为纵坐标作图。

1.7 鲫鱼籽糖蛋白细胞增殖实验

在倒置相差显微镜下观察人体皮肤细胞(HaCat)，汇合度达到90%以上，吸去原培养液，PBS溶液清洗 2 遍，加入 0.25%胰酶 1 mL，37 ℃消化 1 min 后，于倒置相差显微镜下观察细胞。当细胞收缩、变圆且细胞间隙变大时，加入完全培养基1.5 mL终止消化，反复吹打细胞成单细胞悬液，移至 15 mL离心管，1 000 r/min离心 5 min，调整细胞密度为104/mL，每孔 200 μL接种于 96 孔细胞培养板中，使用完全培养基，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养 24 h，并根据实验设计不同时间点加入不同试验药物，每组 3个复孔，培养12～72 h，镜下观察 HaCat细胞形态，当培养时间到达72 h时，各孔中加入 5 mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)20 μL，继续培养 4 h，吸出上清，每孔中加入 150 μL二甲基亚砜(DMSO)，摇床振荡15 min，充分溶解结晶，用酶联免疫测试仪测定570 nm的每孔细胞OD值。细胞存活率的计算见式(2)。

细胞存活率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%

(2)

1.8 鲫鱼籽糖蛋白凝血实验

活化部分凝血活酶时间(APTT)测定。取新鲜兔血于3 000 r/min离心15 min，将上清样品75 μL和待测样品25 μL混匀，加入37 ℃预热的100 μL APTT试剂，在37 ℃水浴孵育5 min，然后加入预热的25 mmol/L的CaCl2溶液100 μL，迅速启动秒表记录凝固时间。以生理盐水作为空白对照，平行实验3次。

凝血酶原时间(PT)测定。将兔血离心的上清样品75 μL和待测样品25 μL混匀，于37 ℃孵育3 min，加入37 ℃预热的PT试剂200 μL，迅速启动秒表记录凝固时间。以生理盐水作为空白对照，平行实验3次。

凝血酶时间(TT)测定。分别取37 ℃预热的待测血浆150 μL和50 μL的待测样品进行混合，加入TT试剂200 μL，记录凝固时间。以生理盐水作为空白对照，平行实验3次。

2 结果与讨论

2.1 鲫鱼籽糖蛋白的粗提取

为了进一步研究鱼籽中糖蛋白的N-糖链结构，笔者采用苯酚浸提除去酯类物质，化学法测定蛋白、总糖和唾液酸的含量。蛋白、总糖和唾液酸的回收率分别为58.2%、36.0%和72.0%。进一步采用SDS-PAGE分析鱼籽细胞破碎液和提取的粗蛋白的分子量分布，结果如图1所示。由图1可知，鲫鱼籽蛋白组成比较复杂，主要分子量部分在1.97×105、2.7×104和2.2×104，与夏光华等[15]所得到的结果类似。对粗糖蛋白采用间苯二酚法测量，测得唾液酸含量占干质量的2%左右，与文献[16]报道的最高略有差距，可能是鱼籽未发育成熟所致。对鲫鱼籽粗蛋白进行电泳胶条进行切割和PAS染色，发现条带上蛋白四周呈红色(条带3)，可以判定鲫鱼籽提取的粗蛋白含有寡糖链。

M—标准蛋白；1—鱼籽细胞破碎上清液；2—粗糖蛋白；3—PAS染色

2.2 唾液酸糖蛋白的色谱分离纯化

对上述提取的鲫鱼籽粗蛋白进行阴离子交换柱层析分离，结果如图2所示。由图2可知，色谱分离峰有2个洗脱峰，经积分发现贯穿峰、峰1和峰2分别占了44.9%、11.0%和44.0%。经检测，峰1和峰2的蛋白都含有唾液酸，因此选择量多的峰2进行下一步研究。

图2 鲫鱼籽唾液酸糖蛋白离子交换色谱分离

2.3 鲫鱼籽唾液酸糖蛋白上寡糖链结构分析

将上述经过阴离子交换纯获得峰2收集液透析除盐，冻干。先用PNGase F酶切处理，获得鲫鱼籽糖蛋白的游离糖链，再用MALDI-TOF质谱进行分析，N-糖链结构推测结果如表1所示。由表1结果可以推断，鲫鱼籽糖蛋白上的寡糖链呈分支状，包括双天线型和三天线型。含唾液酸糖链大约有4种结构类型，糖链末端分布有1～2个NeuAc，连接在半乳糖(Gal)或半乳糖胺上(GalNAc)。

表1 鲫鱼籽糖蛋白上含唾液酸的N-糖链结构

2.4 鲫鱼籽糖蛋白的生物活性

由于鲫鱼籽富含唾液酸糖蛋白，唾液酸糖蛋白有利于预防骨质疏松症[10]。采用磷酸钙沉淀实验进行定性实验测试其阻止磷酸钙沉淀的能力，结果如图3所示。由图3可知，在空白实验中，Ca3(PO4)2沉淀在5～10 min迅速生成;而在加入酪蛋白磷酸肽(CPP)和鲫鱼籽糖蛋白(0.1 g/L)后，Ca3(PO4)2沉淀生成的时间延迟至20～30 min。这说明酪蛋白磷酸肽和鲫鱼籽糖蛋白的加入都能有效延迟Ca3(PO4)2沉淀的生成，表明酪蛋白磷酸肽和鲫鱼籽糖蛋白与Ca2+有很好的络合能力。因此，鲫鱼籽糖蛋白具有较好的阻止磷酸钙沉淀的能力，可用于预防骨质疏松症。

图3 鲫鱼籽唾液酸糖蛋白阻止磷酸钙沉淀测定

一般来说，多糖和寡糖具有较强的自由基清除能力[17-18]。因此进一步评测鲫鱼籽糖蛋白的DPPH自由基清除能力。·DPPH是一种稳定的自由基，其醇溶液呈现强紫色在517nm波长处有强吸收，加入抗氧化剂后517nm波长处的吸光度减弱。结果如图4所示。由图4可知，酪蛋白磷酸肽(CPP)和鲫鱼籽糖蛋白都具有一定的·DPPH清除能力，随着反应不断进行，·DPPH清除率不断增加，而参照物酪蛋白磷酸肽最高达到了28.1%，鲫鱼籽糖蛋白的·DPPH清除率最高达到了14.3%。鲫鱼籽糖蛋白的自由基清除能力虽然只有为CPP的一半，但是也表现出有较好的自由基清除能力，通过增加糖蛋白浓度和纯度可进一步提高自由基清除能力。

图4 鲫鱼籽糖蛋白的抗DPPH·能力测定

2.5 鲫鱼籽糖蛋白的细胞增殖实验

唾液酸糖蛋白具有一定的生理活性，如能够促进皮肤细胞的有丝分裂[19]。进一步选取HaCat进行细胞培养实验，检测其对细胞增长的作用，结果如图5所示。由图5可以看出，随着鲫鱼籽SGP浓度的增加，细胞的存活率在随之上升，并且增值率最高达到了160%，表明鲫鱼籽SGP对HaCat细胞具有促生长作用。但是培养时间超过72 h后，鲫鱼籽SGP的HaCat细胞促生长作用没有不显著，推测为细胞本身的正常凋亡过程。

图5 鲫鱼籽糖蛋白的细胞增殖能力

2.6 鲫鱼籽糖蛋白的凝血活性评价

进一步测定鲫鱼籽糖蛋白的凝血活性，结果如表3所示。由表3可知，添加不同浓度的鲫鱼卵糖蛋白能使APTT、PT、TT均出现凝血时间提前的现象。当鲫鱼籽SGP为5.0 mg/mL时，APTT时间为对照的20.8%，PT时间为对照的30.7%，TT时间为对照的28.6%。该结果表明鲫鱼籽SGP可以通过内源性途径、外源性途径和纤维蛋白原转化等影响凝血过程，具有显著的促凝血活性。

表2 鲫鱼籽糖蛋白的凝血活性时间

对于食材来源唾液酸糖蛋白，目前仅对燕窝和鸡蛋的N-糖链结构进行详细解析，其中燕窝的富含唾液酸糖链70%是3天线型和4天线型分叉糖链结构[7]，而禽蛋的N-糖链主要是以双天线型糖链结构为主，有较为复杂的糖链结构，主要分布在IgG等抗体蛋白上[20]。鲫鱼籽中唾液酸含量较高，本研究通过分析发现其含有双天线和三天线型的糖链结构。另外，在鲫鱼籽糖蛋白N-糖链上，笔者发现唾液酸不仅仅连接在半乳糖基上，还连接在GalNAc上。在抗菌方面，SGP中唾液酸化的α-2,6-GalNAc残基可以作为配体与A型人流感病毒的血凝集素结合，从而抑制流感病毒与人宿主细胞结合[21]；而糖蛋白末端含唾液酸的三糖结构Neu5Ac-α2,3Gal-β1,4GlcNA则能与幽门螺杆菌产生抗结合作用从而发挥抗菌作用[22]。鲫鱼籽SGP含有α-2,6和α-2,3连接的唾液酸化糖链，因此在未来具有广阔的应用空间。此外，鲫鱼籽SGP糖链上可能存在岩藻糖，而且部分岩藻糖连接在糖链分叉端的GlcNAc上，研究表明动物卵细胞岩藻糖化形成的多种不同抗原，对生殖和发育具有重要作用[23]。由于鲫鱼籽SGP对皮肤细胞HaCat具有促生长作用，因此它也有可能用于护肤品领域；另外，它还具有凝血活性，也可以用于止血材料中。

3 结论

鲫鱼籽糖蛋白分子量主要分布在1.97×105、2.7×104和2.2×104左右。结构分析表明鲫鱼籽主要糖蛋白的N-糖链结构为双天线和三天线2种分支结构，大部分N-糖链含有唾液酸。生物活性分析表明，鲫鱼籽糖蛋白具有阻止磷酸钙沉淀能力和一定的DPPH自由基清除能力，另外鲫鱼籽SGP对HaCat细胞的增值有显著性促进作用，最高可达到160%，而且还具有较强的凝血活性。