固定化天冬氨酸酶制备(R)-3-氨基丁酸

张飞龙，杨卫华，陈明亮，严燕兵，唐云平，肖延铭

(1.长兴制药股份有限公司 工业生物催化与转化浙江省工程研究中心，浙江 长兴 313100；2.浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山 316022)

度鲁特韦是人类免疫缺陷病毒类型I(HIV-1)整合酶链转移抑制药，其化学合成所需原料较多，(R)-3-氨基丁醇是其重要原料之一，(R)-3-氨基丁酸(R-3-ABA)主要作为医药中间体(R)-3-氨基丁醇的前体物[1-2]。目前，国内对于(R)-3-氨基丁醇的制备主要还是传统的化学方法，包括：化学拆分法、化学诱导法、手性原料合成法和制备色谱法等。但采用以上方法制备(R)-3-氨基丁醇易对环境造成较大的污染且收率不高，不利于节能减排[3-4]。开发具有高效、低成本的路线合成高纯度的(R)-3-氨基丁酸是降低度鲁特韦原料药成本、推广其应用范围的关键步骤。相对于化学法，利用生物酶法催化技术建立一个低成本、高效、环保，且制备工艺简单，有利于工业化生产的工艺将具有更加广泛的应用前景。

天冬氨酸酶，也称天冬氨酸裂氨酶(EC 4.3.1.1，Asp)，是特异于天冬氨酸或其衍生物为底物的3种类型的氨裂解酶之一，在氮代谢中起着重要的作用，通过催化L-天冬氨酸可逆地消除氨并产生富马酸盐[5-6]。目前研究的几种相关的天冬氨酸酶包括大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌YM55-1。其中研究最多的是大肠杆菌天冬氨酸酶(AspA)和芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶(AspB)[7-10]。AspA是已知最具特异性的酶之一，但AspA对其天然底物的高选择性限制了该酶的实际应用。与AspA相比，AspB具有较高的活性和对映体选择性、广泛的亲核试剂特异性、相对热稳定性以及缺乏底物或金属离子的变构调节，从而在有机合成领域引起了研究者极大的兴趣[11]。

已有研究报道天冬氨酸酶基因T187、K324和N326为底物C1羧基的结合残基，本研究通过克隆构建、定点突变获得了重组天冬氨酸酶(AspBm)[12]，利用酶催化将底物巴豆酸转化为(R)-3-氨基丁酸(图1)。与传统化学方法合成相比，酶法制备更加安全、环保，制成固定化细胞用于工业化生产使得生产成本大大降低[13]。

图1 天冬氨酸酶催化合成(R)-3-氨基丁酸

1 材料与方法

1.1 材料

细菌基因组DNA制备试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA清洁试剂盒，Axygen公司；限制性内切酶、DNA连接酶、DpnⅠ，TaKaRa公司；引物合成和基因测序，杭州擎科梓熙生物技术有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物，Oxoid公司，硅藻土、戊二醛、聚乙烯亚胺、氨水、(NH4)2SO4等均为市售生化试剂。

Bacillussp.YM55-1、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET-28a(+)均保藏于本公司。

LB培养基(g/L)：酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10。

TB培养基(g/L)：酵母膏24、胰蛋白胨12、甘油5、KH2PO42.31、K2HPO4·3H2O 16.43。

1.2 方法

1.2.1 天冬氨酸酶的克隆

根据NCBI数据库中Bacillussp.YM55-1基因序列设计引物，正向引物F：5′-CGCGGATCCATGAATACCGATGTTCGT-3′，反向引物R：5′-CCGCTCGAGTATTTTCTTCCAGCAATTCCCGG-3′(下划线部分分别为BamH Ⅰ和XhoⅠ的限制性酶切位点)。挑取Bacillussp.YM55-1单菌落于LB液体培养基中，37 ℃培养14 h，5 000 r/min离心10 min收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取Bacillussp.YM55-1基因组。以获得的基因组为模板进行PCR，扩增得到天冬氨酸酶基因AspB。扩增程序如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环后72 ℃延伸10 min。PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒纯化，与载体pET-28a(+)分别用BamHⅠ和XhoⅠ于37 ℃双酶切2 h。酶切反应液使用DNA清洁试剂盒纯化后，取适量载体和基因片段，加入DNA连接酶混匀，于16 ℃连接反应12 h。随后加入到E.coliDH5α感受态细胞进行转化，利用卡那霉素抗性筛选得到克隆菌株，测序验证得到重组质粒pET-28a(+)-AspB。

设计天冬氨酸酶基因T187C、K324M和N326C定点突变所需引物，进行定点突变PCR。PCR扩增产物纯化后使用DpnⅠ于37 ℃酶切3 h，随后加入到E.coliDH5ɑ感受态细胞中进行转化，转化液涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基中。挑取单菌落至4 mL LB培养基，37 ℃、220 r/min培养过夜，抽提质粒并送公司测序，确保突变基因正确。将得到的重组突变质粒转入E.coliBL21(DE3)，得到重组表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm。

1.2.2 天冬氨酸酶酶液制备

挑取重组表达菌株单菌落接种到含卡那霉素的4 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养14 h，按体积分数1%接种量接种至200 mL TB液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养，待OD600至0.6～0.8时加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，25 ℃诱导培养16 h。菌液于5 000 r/min离心10 min，收集菌泥，用50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 7.0)重悬2次后，加入50 mmol/L pH 7.0的磷酸盐，超声波破碎(200～400 W，超声3 s，间歇5 s，总共8 min)，在4 ℃条件下，8 000 r/min离心30 min收集上清液。

1.2.3 天冬氨酸酶活力测定

天冬氨酸酶酶活力的测定参照文献[9]进行。1 mL反应体系含50 mmol/L pH 7.0 HEPES缓冲液、0.1 mol/L L-天冬氨酸、100 μL适当稀释浓度的酶液。反应体系于30 ℃反应5 min，立即在240 nm处测定富马酸吸光值的变化。

酶活定义：在30 ℃、pH 7.0条件下每分钟生成1 μmol/L富马酸所需的酶量定义为1个酶活单位，1 U。

1.2.4 SDS-PAGE和蛋白含量测定

SDS-PAGE采用12%分离胶进行电泳。蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法进行。

1.2.5 固定化细胞的制备

将180 mL水加入20 g菌体，充分搅拌，再向菌悬液中加入1.2 g硅藻土和6 mL 5%聚乙烯亚胺，氨水调控pH至9.0，28 ℃充分搅拌1 h。随后向溶液中加入2 mL 25%戊二醛进行交联，维持pH在9.0左右，充分搅拌1 h后进行抽滤，水淋洗2次，4 ℃储存备用。固定化细胞前进行了预实验，设置不同量的硅藻土、聚乙烯亚胺和戊二醛，在上述参数下，天冬氨酸酶固定化细胞酶活最高。

1.2.6 天冬氨酸酶催化体系

催化体系为(g/L)巴豆酸185、MgSO42.4、(NH4)2SO458.8；氨水调pH至8.2。固定化天冬氨酸酶菌体量30 g/L，反应温度为40 ℃，反应开始后氨水调控pH在8.9～9.1。

2 结果与讨论

2.1 天冬氨酸酶在E.coli BL21(DE3)中的表达

重组表达菌株进行诱导表达，超声波破碎后进行SDS-PAGE，结果见图2。由图2可知，天冬氨酸酶大部分存在于上清液中，在分子量为(4.43～6.64)×104位置有明显的表达条带，与pET-28a(+)-AspBm理论5.16×104大小相近。

1—E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm IPTG诱导前样；2—E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm破碎上清液；M—标准蛋白

2.2 固定化细胞催化合成(R)-3-氨基丁酸的条件优化

2.2.1 缓冲液pH对催化反应的影响

图3 缓冲液pH对反应的影响

2.2.2 温度对催化反应的影响

保持其他反应条件相同，设置不同反应温度，考察温度对反应的影响，结果见图4。由图4可知，随着温度的升高，酶活得到逐步提高，在40 ℃达到最大。当温度提高到45 ℃时，相对酶活仅有85.7%，考虑可能是温度过高导致天冬氨酸酶的稳定性变差，从而使酶活变低。因此选择40 ℃作为最佳反应温度。

图4 温度对反应的影响

2.2.3 菌体量对催化反应的影响

保持其他反应条件相同，设置不同反应菌体量，考察菌体量对反应的影响，结果见图5。由图5可见，(R)-3-氨基丁酸的质量浓度随着菌体量的增加而逐渐得到提高，在菌体量为30 g/L时，底物转化接近99%，进一步增加菌体量会对后续的产物分离造成一定的困难，同时也存在一定程度的浪费，因此最佳菌体量选择为30 g/L。

图5 菌体量对反应的影响

2.2.4 反应时间对催化反应的影响

其他反应条件不变，考察反应时间对反应的影响，结果如图6所示。由图6可知，随着反应时间的延长，产物质量浓度得到不断地提高。在反应前16 h反应速率较快，在22 h后产物质量浓度的增长变得更加缓慢，一方面可能是反应时间过长，酶活力降低，另一方面可能是反应达到平衡。结合实际生产，反应时间选择在22 h。

图6 反应时间对反应的影响

2.2.5 固定化AspBm催化巴豆酸产(R)-3-氨基丁酸

巴豆酸经固定化AspBm催化反应22 h后，产物(R)-3-氨基丁酸收率为97.8%。利用HPLC分析反应18 h和26 h的情况，结果如图7所示。由图7可知，反应26 h转化液几乎已无巴豆酸残留，反应较为彻底。

图7 固定化细胞催化巴豆酸反应18和26 h的HPLC图谱

2.2.6 重复使用次数

在上述最优条件下进行固定化细胞酶促反应，每批次反应结束后检测(R)-3-氨基丁酸的质量浓度，固定化细胞经清洗后立即进入下批次的转化反应。固定化细胞重复使用次数的结果如图8所示。由图8可知，固定化细胞可重复使用次数不低于24次，此时(R)-3-氨基丁酸的产率达到89.2%。随着反应批次的继续增多，产率逐渐减小。

图8 固定化细胞重复使用次数对反应的影响

3 结论

从Bacillussp.YM55-1中克隆得到天冬氨酸酶基因，对其序列进行分析，作定点突变，并利用大肠杆菌作为表达宿主，实现了Bacillussp.YM55-1 Asp基因的异源表达。将天冬氨酸酶基因工程菌制备成固定化细胞，考察不同反应条件对天冬氨酸酶催化生成(R)-3-氨基丁酸产量的影响，结果发现：反应缓冲液pH控制在9.0、反应温度40 ℃、反应时间22 h、菌体量为30 g/L时，产物的质量浓度能达到220 g/L，转化率达到98%以上。基因工程菌固定化细胞多达24次的重复使用，使得工业化生产(R)-3-氨基丁酸的成本得到显著降低。在本项目研究过程中，发现随着底物巴豆酸质量浓度的提高，天冬氨酸酶耐受性变差，反应转化率随之降低。倘若通过诸如一些分子生物学方面的技术来改造天冬氨酸酶，或许可以提高酶的稳定性和酶活力，从而使工业化生产成本得到进一步的降低，同时对于降低度鲁特韦的售价也能起到一定的作用。