静置的固定化荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)生物反应器中催化合成乙酸香茅酯

张 蒙，丛方地,，任德忠,王晓红，王鑫鑫，张树林，罗 巍

(1.天津农学院 基础科学学院，天津 300384; 2.天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

乙酸香茅酯属于萜烯短链脂肪酸酯类化合物，作为天然香精和香料的重要组成成分[1]，存在于玫瑰油和香茅油中，具有柠檬气味的鲜果香气[2]，可以调制出多种香型香精，现已广泛应用于食品、化妆品和医药等行业[3]，具有很大的应用价值。目前香茅酯的生产，除少部分从天然植物中提取，大部分为化学法合成[4-5]，但化学合成对反应条件要求苛刻，且通常有副反应发生等。所以，香茅酯的制备逐渐偏向生物法转化[4]，特别是酶促合成法。因为酶促合成的反应条件温和、选择性高、副反应少且对环境污染小。因而，酶促合成香茅酯的方法越来越受到重视。为更有效地酶促合成香茅酯，本文中，笔者将荧光假单胞菌脂肪酶Pseudomonasfluorescenslipase(PFL)固定在脱脂棉纤维上，与柱形瓶或滴定管形成简易的生物反应器，并参考相关研究[6-13]，在非水相条件下，用于催化香茅醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应生成乙酸香茅酯，研究瓶型生物反应器和管式生物反应器的催化活性和稳定性。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

仪盟A90型气相色谱仪(GC，配有氢火焰检测器和SE-30毛细管柱30 m×0.32 mm，0.33 μm)，上海仪盟电子科技有限公司；HZQ-Q型恒温振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；BSC-150型恒温培养箱，杭州康纳科技有限公司；FA2104A型电子天平，上海精天电子仪器有限公司。

脂肪酶PFL(20 U/mg)，杭州创科生物科技有限公司；香茅醇、乙酸乙烯酯、正己烷、无水乙醇及其他化学试剂为市售分析纯。医用脱脂棉购于市场，试验前，取20 g脱脂棉置于250 mL烧杯中，向烧杯中加入无水乙醇至完全浸没脱脂棉，将烧杯用封口膜密封，浸泡48 h。用镊子取出，用乙醇洗2次，然后放入另一烧杯，用纱布封口，晾干，备用。

1.2 PFL的固定化

10 mg的PFL酶粉放入10 mL柱形玻璃瓶中，加200 μL蒸馏水，轻轻摇动使酶粉充分溶解，再加10 mg脱脂棉，充分吸附酶溶液。此瓶敞口置于恒温摇床中，在37 ℃、160 r/min，保持8 h[9]，得固定在脱脂棉上的PFL——脱脂棉-PFL。用镊子撕拉脱脂棉-PFL至蓬松，连同柱形瓶形成简易的脱脂棉-PFL瓶型生物反应器(图1)，保鲜膜封口，备用。然后在表面皿中心部位加10 mg的PFL酶粉、200 μL蒸馏水，充分溶解，用10 mg脱脂棉充分吸附。将此表面皿置于恒温箱中，在37 ℃保持50 min以上，用镊子撕拉所得脱脂棉-PFL至蓬松，放于烧杯中，保鲜膜封口，备用。

1.3 酶促合成乙酸香茅酯

在含有脱脂棉-PFL和PFL酶粉的10 mL柱形玻璃瓶中，分别加入1 mL香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加盖并用保鲜膜密封，在37 ℃、160 r/min下反应。每个体系中的PFL酶粉的质量均为10 mg。同时，按照上述方法准备两个同样的反应体系，在37 ℃下恒温静置。上述所有反应体系，每隔2 h，取样分析。此外，在7个脱脂棉-PFL瓶型生物反应器中分别加入1 mL香茅醇、1～7 mL体积不等的乙酸乙烯酯，加盖并用保鲜膜密封，37 ℃恒温静置24 h，取样分析。在5个脱脂棉-PFL瓶型生物反应器中，分别加入1 mL香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加盖并用保鲜膜密封，分别放在25、30、35、40和45 ℃静置反应24 h，取样分析。

1.4 脱脂棉-PFL瓶型生物反应器再应用

在脱脂棉-PFL瓶型生物反应器中，分别加入1 mL 香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加盖并用保鲜膜密封，37 ℃恒温静置24 h，取样分析。然后，将反应液倒出，并用正己烷冲洗3次，敞口放置 10 min，使残余正己烷完全挥发。重新向反应器中加入1 mL香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加盖并用保鲜膜密封，在37 ℃静置24 h，取样分析。如此，操作共6次。

1.5 2种脱脂棉-PFL催化合成乙酸香茅酯

在脱脂棉-PFL瓶型生物反应器中，加入1 mL香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加盖并用保鲜膜密封，在37 ℃静置，并按时取样分析。此外，在10 mL柱形玻璃瓶中，加入在表面皿中固定得到的脱脂棉-PFL(固定量：脱脂棉10 mg，PFL酶10 mg)，加入相应量的反应液，并在同样条件下催化反应，按时取样分析。

1.6 脱脂棉-PFL在滴定管中催化合成乙酸香茅酯

在表面皿中固定得到的脱脂棉-PFL(固定量：脱脂棉50 mg，PFL酶50 mg)拉伸至蓬松，装入酸式滴定管中。香茅醇与乙酸乙烯酯按体积比1∶ 2混合均匀，加入到酸式滴定管(图1(b))中。放出1.5 mL反应液后，驱赶气泡，关闭开关并计时，1 h后，打开开关，将与脱脂棉-PFL接触的反应液(3 mL)放出，关闭开关，放出液取样分析。此后，每隔2、3、4、5、6、8、14和16 h，分别放出反应液，并取样分析。

图1 脱脂棉-PFL瓶型(a)和管式(b)反应器

1.7 色谱分析方法

取样 20 μL，用1 mL 正己烷稀释，0.25 μm滤膜过滤，进样1 μL，GC 分析。色谱条件为N2(0.4 MPa，分流比1∶ 1)，110 ℃，保留 1 min；15 ℃/min，200 ℃，保留 1 min。进样和检测温度分别为280和 300 ℃。香茅醇和乙酸香茅酯的保留时间分别为4.4和5.5 min，根据它们的峰面积计算底物的摩尔转化率[14]。

2 结果与讨论

2.1 摇动和静置状态下的酶促反应动力学

在柱形瓶中，通过物理吸附作用，将脂肪酶PFL固定在脱脂棉上，形成固定化酶脱脂棉-PFL，并将其撕拉至蓬松，以增加其比表面积[10]，使反应液与固定化酶接触充分。脱脂棉-PFL与柱形瓶一起形成一种简易的瓶型生物反应器，分别在摇动和静置条件下(37 ℃)，催化合成乙酸香茅酯，并与酶粉的催化效果相比较，结果见图2。

图2 脱脂棉-PFL和PFL酶粉的酶促反应动力学(37 ℃)

由图2可知，在摇动和静置条件下，脱脂棉-PFL瓶型生物反应器中底物的转化率明显高于酶粉催化的体系。同时，在摇动和静置条件下，脱脂棉-PFL瓶型生物反应器转化底物的能力相近。这可能是由于脱脂棉-PFL具有蓬松结构和柔软特性的原因，可以考虑优先在静置条件下催化合成乙酸香茅酯。

2.2 底物比对脱脂棉-PFL瓶型生物反应器催化作用的影响

香茅醇的量定为1 mL，乙酸乙烯酯的用量，由1 mL逐渐增加至7 mL[15]，反应24 h，脱脂棉-PFL生物反应器催化反应的转化率结果见图3。由图3可知，当乙酸乙烯酯为1 mL时，反应的转化率为86.0%；乙酸乙烯酯为2 mL时，转化率达99.1%。乙酸乙烯酯用量进一步加大，反应的转化率略有下降，但均在97%以上，这可能是增加乙酸乙烯酯造成底物香茅醇浓度降低的原因。可见，香茅醇与乙酸乙烯酯的体积比为1∶ 2最适宜。

图3 酰化试剂用量对酶促转化率的影响(37 ℃，24 h)

2.3 温度对脱脂棉-PFL生物反应器催化作用的影响

设置5个温度梯度，研究温度对脱脂棉-PFL生物反应器催化作用的影响。在静置条件下催化反应24 h，各个反应体系的转化率结果见图4。由图4可知，随温度上升，转化率显著升高；在35和40 ℃，转化率较高，达到98%以上。因此，酶促反应的温度可恒定在37 ℃进行。

图4 温度对脱脂棉-PFL催化转化率的影响

图5 6次脱脂棉-PFL瓶型生物反应器催化反应24 h后的转化率(a)和第6次催化后反应液的气相色谱图(b)

2.4 脱脂棉-PFL瓶型生物反应器的重复利用

酶活性在非水相中容易因酶蛋白变性而降低[17]，为验证脱脂棉-PFL瓶型生物反应器的非水相稳定性，循环使用它催化香茅醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应，每次催化24 h。以第1次催化后的反应转化率作为酶的非水相初始活力[18]，即99.0%，第6次的转化率作为衰减后的酶活力，即94.0%。后5次使用后反应活力降低了5.0%，反应的活力衰减率为5.0%÷(24×5)=0.04%，这是一个较小的数值[9]。可见，脱脂棉-PFL瓶型生物反应器在非水相条件下的活性是比较稳定的，反应器可以多次利用。重复使用时，基于脱脂棉-PFL瓶型生物反应器稳定性的少许降低，可以通过延长反应时间来适当提高酶生物反应器的催化效率。

2.5 2种脱脂棉-PFL的催化效果

在柱形玻璃瓶中制备脱脂棉-PFL，因瓶口狭小，水分挥发相对较慢，在37 ℃、160 r/mim条件下固定10 mg的PFL需要8 h。而在表面皿上固定同量的PFL，只需37 ℃恒温静置90 min。在37 ℃静置的柱形瓶中，2种脱脂棉-PFL催化转酯反应24 h，结果如图6所示。由图6可知，在表面皿中固定得到的脱脂棉-PFL，活性相对较低，但催化反应24 h后，转化率也达到77.1%，活性低的原因，为脱脂棉-PFL从表面皿转移到柱形瓶的过程中有损失，经称质量得知酶的损失率约为9%。

图6 2种方法制备的脱脂棉-PFL的酶促反应动力学

2.6 脱脂棉-PFL在滴定管中催化反应

脱脂棉-PFL不因静置而明显影响其催化活性，且在25 ℃时也表现出较好的活性。为此，可以将在表面皿中固定得到的脱脂棉-PFL装入酸式滴定管形成管式生物反应器进行催化反应。将脱脂棉-PFL(固定量：脱脂棉50 mg，PFL酶粉50 mg)拉至蓬松，小心地加入到酸式滴定管中，然后将香茅醇和乙酸乙烯酯按照1∶ 2的体积比充分混合，并加入到滴定管中催化反应，结果见图7。

图7 脱脂棉-PFL管式反应器中催化反应的转化率

由图7可知，反应4 h酶促转酯反应的转化率可达到68.5%，继续延长反应时间，转化率增加较慢。这可能因为脱脂棉-PFL区域的反应液与没有酶的上部区域的反应液之间的扩散有关。这种不足，可以通过以后进一步的改进装置来提高转化率，以达到应用于实际工业生产的目的。

3 结论

通过在脱脂棉上固定PFL，制备固定化酶脱脂棉-PFL，并与反应装置一起形成简易的生物反应器，催化香茅醇和乙酸乙烯酯(体积比1∶ 2)反应合成乙酸香茅酯。在37 ℃、静置条件下的脱脂棉-PFL瓶型生物反应器中，催化反应24 h，转化率可以达到96%以上。在室温、静置条件下的脱脂棉管式生物反应器中，催化反应4 h，转化率达68.5%。与传统催化方法的强酸强碱、高温等催化条件相比，本方法反应条件绿色、低碳且操作简单。经过进一步改善反应器的结构，可望应用到工业生产当中去，形成一套低碳、高效、绿色环保的生产工艺。