星点设计效应面法优化姜黄素微球的制备工艺

王梦范，张丹丹

(青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266000)

姜黄素是从姜科植物中提取的一种化学成分，主要临床作用有抗炎、抗氧化[1]、降血脂、治疗肠道疾病[2]以及抗癌[3-4]等。

姜黄素存在水溶性差(0.03 μmol/L)[5]、体内不易吸收而且易代谢等缺点，在临床上还未被很好地开发利用。现阶段对姜黄素研究的重点是进行剂型改造以提高其溶解性能[6]，进而提高生物利用度。目前可以提高难溶性物质溶解性的制剂技术有微囊化制剂技术[7]、包合物制剂技术[8]、脂质体制剂技术[9]和纳米粒制剂技术[10]等。

微球技术作为一种新制剂新技术，具有明显的缓释作用，能明显提高药物的生物利用度和稳定性，并且对人体的刺激性小，体内释放速度缓慢，可以提高药物的治疗作用。本文中，笔者通过乳化溶剂扩散法制备姜黄素微球，以单因素试验法和星点效应面法优化试验，以期得到最佳包封率处方，提高姜黄素生物利用度。

1 材料与方法

1.1 试验材料

姜黄素(HPLC纯度大于60%)，深圳恒生生物科技有限公司；乙基纤维素(药用级)，泰安瑞泰纤维素有限公司；吐温80(Tween80，化学纯)、十二烷基硫酸钠(化学纯)，天津博迪化工股份有限公司；乙酸乙酯(化学纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇(化学纯)，烟台三和化学试剂有限公司；KH2PO4(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

IT-09A型磁力搅拌器，上海一恒科学仪器有限公司；RCZ-8A型智能药物溶出仪，天津大学精密仪器厂；KH-250DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；LabTech型紫外分光光度计，北京莱伯泰科仪器有限公司；XSP-2CA型生物显微镜，上海精科实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 姜黄素微球的制备

按照文献[11]，精密称量一定量的乙基纤维素溶于20 mL乙酸乙酯中，加入0.1 g姜黄素溶解，为油相；向乙酸乙酯的水饱和溶液中加入一定量的吐温80，搅拌均匀，为水相。设置转速(550～800 r/min)、搅拌时间(30～150 min)等条件，向水相中缓慢加入油相，继续搅拌得姜黄素微球乳液。向制备好的微球乳液中缓慢加入大量水(体积为乙酸乙酯的8倍)，使乙酸乙酯充分扩散到水中，将姜黄素微球沉淀出来，静置0.5 h，过滤，并用水冲洗，烘干即得姜黄素微球。

1.3.2 单因素试验

根据姜黄素微球的制剂处方，对影响微球性能的因素如乙基纤维素与姜黄素的质量比、吐温80的用量、磁力搅拌器的转速、搅拌时间及油相水相体积比等设计了5个因素的试验，且每个因素下设5个水平，以包封率为评价指标筛选最佳制备工艺。

1.3.3 星点试验

单因素试验中，对包封率影响较大的因素为乙基纤维素与姜黄素的质量比(X1)、吐温80的用量(X2)和水相油相的体积比(X3)。单因素试验选择的优化范围为m(乙基纤维素)∶m(姜黄素)=(15～25)∶ 1、吐温80用量为10～30 mg/mL、V(水相)∶V(油相)=(1～3)∶ 1。因此，对这3个因素进行星点设计试验，设计5水平，优化制备工艺。各因素的5水平见表1。

表1 因素水平表

1.3.4 微球载药量及包封率的测定

1)标准曲线的建立。配制30 μg/mL的姜黄素乙醇溶液作为储备液。精密移取一定量的储备液，用无水乙醇配制2.25、3.00、3.75、4.50、5.25和6.00 μg/mL的标准溶液。以无水乙醇为空白对照，在423 nm[12]的波长下用紫外分光光度计测定吸光值A423，然后以姜黄素质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值A423(y)为纵坐标，建立标准曲线，得线性方程为y=0.093 16x+0.018 1(R2=0.999)，在2.25～6.00 μg/mL范围内线性关系良好。

2)姜黄素微球载药量及包封率的测定。精密称取等量姜黄素微球于烧杯中，加入适量的无水乙醇，超声溶解后转移至容量瓶中，定容。以无水乙醇为空白对照，在423 nm的波长下测定吸光值A423，代入标准曲线方程中，计算出微球中姜黄素的含量，再根据药物含量得出微球的载药量和包封率，具体计算见式(1)～(2)。

载药量=微球中药物的量/微球的质量×100%

(1)

包封率=微球中药物的量/投入药量×100%

(2)

1.3.5 微球体外释放度试验

参照文献[13]中“释放度测定第二法(桨法)测定释放度”，设置转速75 r/min、温度37 ℃、溶出介质体积500 mL，测定姜黄素对照品与姜黄素微球在人工胃液(含有0.2%的十二烷基硫酸钠)中的释放度。在0.5、1、2、3、4、6、8、10和12 h时取样，过滤，测吸光值，计算累积释放度，绘制释放度曲线。

1.3.6 微球形态观察

在光学显微镜下观察姜黄素微球形态。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙基纤维素与姜黄素的质量比对包封率的影响

考察乙基纤维素与姜黄素的质量比对包封率的影响，结果如图1所示。

图1 乙基纤维素与姜黄素的质量比对包封率的影响

由图1可知:随着乙基纤维素比例的增大，姜黄素微球的包封率逐渐增大，当m(乙基纤维素)∶m(姜黄素)为20∶ 1时，包封率最大，为88.12%；随着乙基纤维素的比例再增大，包封率反而降低，可能是乙基纤维素用量过大时，制备的微球粒径较大，部分原材料黏连，造成微球成型困难，包封率低。

2.1.2 吐温80用量对包封率的影响

吐温80在处方中作为乳化剂使用，降低表面张力使油相和水相均匀分散，使微球粒径均匀。因此，考察吐温80用量对包封率的影响，结果如图2所示。

由图2可知：随着吐温80用量的增大，姜黄素微球的包封率先增大后减小，当吐温80用量为20 mg/mL时，包封率最大，为84.16%；随着吐温80浓度再增大，包封率反而降低，可能是吐温80用量变大使得微球粒径变小，比表面积变大，囊材不足以包封所有药物，导致包封率降低。

图2 吐温80用量对包封率的影响

2.1.3 转速及对包封率的影响

考察转速对包封率的影响，结果如图3所示。由图3可知，转速为550～600 r/min时，包封率略有增大，但转速为600～800 r/min时，包封率变化较小。由此可见，转速为600 r/min时，包封率最佳(86.82%)，因此选择600 r/min作为姜黄素微球制备时的最佳转速。

图3 转速对包封率的影响

2.1.4 搅拌时间对包封率的影响

考察搅拌时间对包封率的影响，结果如图4所示。由图4可知，当搅拌时间在30～150 min时，对包封率的影响较小，包封率为82.22%～89.22%。同时，考虑到节约成本，选择30 min作为姜黄素微球制备时的最佳搅拌时间。

图4 搅拌时间对包封率的影响

2.1.5 水相油相体积比对包封率的影响

考察水相油相体积比对包封率的影响，结果如图5所示。由图5可知，在水相油相体积比为1时，包封率最大，为88.36%，但水相体积再增大时包封率降低，可能是水相体积过大，相同的转速条件下搅拌不够充分，使包封率降低将此结果作为考察依据，选择星点试验优化范围为V(水相)∶V(油相)为(1～3)∶ 1。

图5 水相与油相的体积比对包封率的影响

2.2 效应面试验结果

2.2.1 模型的建立与效应面结果分析

单因素试验结果中影响因素较大的为乙基纤维素与姜黄素的质量比(X1)、吐温80的用量(X2)和油相水相的体积比(X3)，因此，以包封率为评价指标(即响应值)，确定最优制备处方，结果如表2所示。

表2 星点试验设计及结果

根据结果，应用Design-Expert 8.0软件，以包封率为因变量(Y)，乙基纤维素与姜黄素的质量比(X1)，吐温80的用量(X2)，油相和水相的体积比(X3)为自变量，进行二项式拟合，可得包封率(Y)对各自变量二次多项回归方程：Y=93.53+0.72X1+1.41X2-3.63X3-3.2392-2.65X22-X32(R2=0.980 6)。由此可知，采用二次多项式拟合较为准确。二次多项式拟合方差分析及可靠性分析见表3及表4。

由表3可知，模型的P<0.000 1，表明该二次多项式方程的显著性极高，可正确反映乙基纤维素与姜黄素的质量比(X1)、吐温80的用量(X2)和水相油相的体积比(X3)之间的关系。失拟项(Lack of Fit)为0.375 8>0.05，说明该回归方程与试验结果的拟合度较高[14]。X1、X2、X3、X1X2、X12、X22和X32的P值均小于0.05，表明各因素对姜黄素包封率的影响显著。表4中变异系数为1.17，这表明模型稳定。

表3 包封率回归模型方差分析

表4 回归方程的可靠性分析

表3中，各变量F值越大，表明对微球的包封率影响越大，各因素对包封率的影响由大到小为C、B、A，即水相油相体积比，吐温80用量，乙基纤维素与姜黄素质量比。

2.2.2 效应面分析与条件优化

运用Design-Expert 8.0描绘因变量和自变量的三维效应面和二维等高图，各因素交互作用的结果见图6。

图6 各因素对姜黄素微球包封率的效应面图

由图6可知，3D效应曲面图显示了最大值和最小值区域，各因素对包封率的影响越大，曲面越陡峭，各因素的最佳值为X1为20.04、X2为21.68、X3为1.47。

2.3 验证试验

将星点设计优化的最佳值X1为20.04、X2为21.68、X3为1.47，代入处方，设计验证试验，制备3批姜黄素微球，在光学显微镜下观察姜黄素微球的形态，并计算包封率和载药量，进行体外释放度试验，验证试验结果见表5。

表5 验证试验结果

由表5可知，优化后的姜黄素微球的制备工艺水平明显提高，包封率较高，与预测值较为接近，且偏差较小，说明星点试验效应面优化的处方条件可行。

2.4 载药量及累积释放度

测定验证批微球的载药量，结果见表6。

表6 载药量及累积释放度

由表6可知，3批姜黄素微球的平均载药量为7.52%，累积溶出度在6 h时达平衡，12 h时平均释放度为83.11%，与原料药相比，有良好的缓释效果。

2.5 微球形态观察

在光学显微镜下观察姜黄素微球形态，结果见图7。由图7可知，微球形态圆整、大小较均匀，粒径范围为20～80 μm。

图7 姜黄素微球形态(×100)

3 结论

采用乳化溶剂扩散法制备姜黄素微球，通过单因素试验初步优化制备工艺，利用单因素试验结果设计星点试验，进一步优化制备工艺。星点设计所得到的最佳制备处方为乙基纤维素与姜黄素的质量比为20.04、吐温80的用量为21.68 mg/mL、油相水相体积比为1.47，制备的姜黄素微球的质量最佳，即微球形态圆整、大小较均匀，包封率高达93.66%，载药量在7%以上，并且通过体外释放度试验证明了本试验所制备的姜黄素微球具有明显的缓释作用。