碳酸氢钠对酵母细胞活性及冷冻面团品质的影响

李 娜，缪冶炼，邢 丽，卢 发，张燕萍

(1.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800；2.安琪酵母股份有限公司生物技术研究院，湖北 宜昌 443003；3.丹阳市同乐面粉有限公司，江苏 丹阳 212351)

馒头和面包是以小麦粉、膨松剂为主要原料制成面团，通过醒发、蒸制或焙烤加工而成、具有内部多孔结构的食品。随着人们对新鲜馒头和面包需求的不断增加，冷冻面团技术受到食品加工行业的广泛关注。利用冷冻面团技术，不但能够随时提供新鲜的馒头和面包，而且便于产品的规模化和标准化生产，节约人工和设备投资，降低生产成本[1-3]。

酵母是馒头和面包加工中最常用的生物膨松剂。酵母在面团中进行有氧呼吸和无氧呼吸，产生CO2，使面团形成多孔网络结构。此外，酵母作为膨松剂还具有以下优点；①酵母自身具有丰富的营养；②酵母产植酸酶能分解植酸，避免植酸对消化系统内铁、钙和锌等微量元素吸收的干扰，同时提高制品中维生素B的含量[4]；③发酵产生酒精、有机酸、酯类和羰基化合物，制品风味独特[5]。然而，当酵母用于冷冻面团加工时，会由于冰晶的形成而受到损伤甚至死亡，影响面团的醒发速度以及制品的比容和风味。此外，冰晶还会破坏面筋结构，影响面团持气力[6-8]。

碳酸氢钠(NaHCO3)是一种传统的化学膨松剂。NaHCO3虽然不能产生酵母那样的风味，但价格低廉，使用方便，醒发速度快[9]。Zolfaghari等[4]分别以老面、酵母、NaHCO3以及酵母与NaHCO3混配为膨松剂，加工扁平状面包，差示扫描量热法(DSC)分析结果显示，与单一老面、酵母或NaHCO3相比，酵母与NaHCO3混配为膨松剂的面包比焓较低、老化较慢、硬度较小;此外，扫描电子显微镜(SEM)观察发现，酵母以及酵母与NaHCO3混配的面包气孔较大、孔壁较薄。Wang等[2]比较了酵母醒发面团(YLD)和化学醒发面团(CLD)在反复冷冻/解冻循环中的醒发稳定性，经过3次冷冻/解冻循环后，CLD的馒头品质好于YLD。其原因在于，CLD的产气能力没有显著变化，而YLD的酵母活细胞数减少、产气能力降低；CLD面筋网络结构的破损小于YLD，CLD馒头弹性下降不明显。由此可见，化学膨松剂在面团中的CO2产气能力稳定且不受冷冻的影响。这是化学膨松剂的另一重要特点。

为了解决冷冻面团的酵母细胞活性和持气力下降问题，本文中，笔者提出酵母与NaHCO3混配的新途径，旨在探明NaHCO3对酵母细胞活性和冷冻面团品质的影响。采用一定用量的酵母和不同用量的NaHCO3制备冷冻面团，测定冷冻面团的酵母发酵力、酵母细胞数、持气力和双硫键含量；然后将冷冻面团蒸制成馒头，对馒头进行感官评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 面团原料

面团原料包括小麦粉、酵母、NaHCO3、食用盐、色拉油、白砂糖和水。小麦粉由丹阳市同乐面粉公司提供。该小麦粉含有水分11.6%、蛋白质8.3%、淀粉73.1%[3]。酵母采用市售耐高糖活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)。在使用前对干酵母进行活化处理，即称取一定量的干酵母于烧杯中，干酵母质量(g)与糖水体积(mL)以1∶ 20的比例加入2%糖水，搅拌均匀，于30 ℃的恒温箱中静置40 min，测定酵母悬液的细胞数。NaHCO3(食品级)由南京市某食品公司生产。此外，食用盐、色拉油和白砂糖购于超市。所有实验采用去离子水。

1.1.2 试剂

三羟甲基氨基甲烷(Tris,BR)，国药集团化学试剂有限公司；甘氨酸(AR)、盐酸胍(AR)，中国惠兴生化试剂有限公司；5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，AR)，阿拉丁试剂有限公司；三氯乙酸(TCA，AR)、乙二胺四乙酸(EDTA，AR)，上海凌峰化学试剂有限公司；尿素(AR)，西陇科学股份有限公司。

1.2 仪器与设备

WH-220HT型磁力加热搅拌器，德国Wiggeng公司；GL-20G-II型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；ZQST250型手持式超声波细胞粉碎机，上海争巧科学仪器有限公司；SK-1型快速混匀器，常州国华电器有限公司；SHP-150型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；PH400型台式基础型pH计,安莱立思仪器科技(上海)有限公司；BD-190W型冰柜，海尔集团；Datacolor 600型测色配色仪，Datacolor公司；UV-1900PC型紫外分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司。

1.3 面团制备

面团配方以小麦粉(100 g)为基准设定。NaHCO3用量分别设定为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，酵母2.0×1010个细胞(相当于每100 g小麦粉中含1 g干酵母)、食用盐1.5%、色拉油4.0%、白砂糖6.0%和水60.0%保持一定。

在25 ℃的室内，按照配方称取原料，均匀混合，用力揉捏15 min(揉捏次数大约为100次)，然后分割成每个100 g的小块，滚圆成型，作为新鲜面团。新鲜面团在-20 ℃条件下冷冻5 h，然后装入聚乙烯材质的封口袋中，在-20 ℃条件下冻藏7 d，作为冷冻面团。

冷冻面团使用前,在20 ℃、相对湿度80%的条件下解冻。当面团中心温度达到5 ℃左右时取出面团，在25 ℃的室内揉捏2 min。

1.4 面团的酵母发酵力、酵母细胞数和pH测定

1.4.1 酵母发酵力测定

新鲜面团或解冻后冷冻面团的酵母发酵力根据文献[10]测定。发酵温度设定为30 ℃，面团用量设定为300 g。面团投入后第8分钟开始测定2 h中的排水量(即CO2的产生量，单位：mL)，并将该排水量定义为酵母发酵力。预试验中，在同样条件(30 ℃，2 h)下测定了由NaHCO3分解产生的CO2量，当NaHCO3用量为最大值的1%时，产气量仅31 mL。与酵母发酵力(大于620 mL)相比，NaHCO3的产气量极少，可忽略不计。

1.4.2 酵母细胞数测定

将新鲜面团或解冻后冷冻面团在温度30 ℃、相对湿度80%的条件下醒发2 h，使面团状态与酵母发酵力测定后基本相同。醒发后，分别从面团的上部、中心和底部的3个部位各取5 g样品于300 mL烧杯中，加入适量的去离子水，搅拌(5 min)均匀，用去离子水定容至500 mL，作为面团悬液。

采用血小板计数法[3,11]测定面团悬液中酵母的细胞数。测定前，根据需要用去离子水将面团悬液稀释适当倍数，取0.1 mL稀释液和0.9 mL美蓝液于试管中，染色10 min。然后，在显微镜下对活细胞(白色)进行计数。根据面团悬液的细胞数和小麦粉量，计算面团中每100 g小麦粉所含的细胞数。

1.4.3 pH测定

从每个新鲜面团或解冻后冷冻面团的中心部取试样10 g，立即加入去离子水150 mL，磁力搅拌10 min，使之分散均匀，作为测试液[2,12]。测试液的pH采用pH计测定。

1.5 面团的持气力和双硫键含量测定

1.5.1 持气力测定

将新鲜面团或解冻后冷冻面团100 g均匀填入经过刻度标定的500 mL高型烧杯(最小刻度10 mL)中，在30 ℃、相对湿度80%的条件下醒发，10 min间隔记录一次面团体积。面团持气力定义为醒发后面团达到的最大体积减去醒发前的面团体积(mL)。

1.5.2 双硫键含量测定

新鲜面团或解冻后冷冻面团中双硫键含量的测定根据Deng等[13]的方法，略做调整。精确称取0.25 g面团，加入10 mL Tris-甘氨酸缓冲液，采用超声波细胞粉碎机粉碎成悬浊液。在悬浊液中加入12.0 g盐酸胍，于25 ℃的水浴中静置5 min，然后在6 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，用Tris-甘氨酸缓冲溶液定容至25 mL，作为样品溶液。取1 mL样品溶液，加入4 mL尿素-盐酸胍溶液和0.05 mL Ellman试剂，作为游离巯基溶液。另取1 mL样品溶液，加入4 mL尿素-盐酸胍溶液和0.05 mL 2-巯基乙醇(β-巯基乙醇)，于25 ℃水浴中静置1 h，然后加入10 mL 12%三氯乙酸(TCA)，继续于25 ℃水浴中静置1 h。将反应液在6 000 r/min的条件下离心10 min，用5 mL 12%TCA清洗沉淀物，再离心，重复清洗2次。将沉淀物溶于10 mL 8 mol/L尿素溶液中，加入0.04 mL Ellman试剂，用0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH至8.0，作为总巯基溶液，记录其体积(mL)。

将上述游离巯基溶液和总巯基溶液在常温条件下静置6 min后，以不加样品溶液的试剂作为空白对照，在波长412 nm处分别测定游离巯基溶液和总巯基溶液的吸光值。面团中游离巯基、总巯基和双硫键的含量以100 g小麦粉为基准表示，分别按式(1)～(3)计算。

(1)

式中：X为面团的游离巯基含量，mmol(以100 g小麦粉计)；73.53为巯基摩尔吸光值的换算系数，μmol·cm/mL；Af为游离巯基溶液在412 nm处的吸光值，；Df为样品溶液至游离巯基溶液的稀释倍数；C为样品溶液的面团质量浓度，g/mL；ω为面团的小麦粉含量，g/g；10-4为单位换算系数。

(2)

式中：N为面团的总巯基含量，mmol(以100 g小麦粉计)；At为总巯基溶液在412 nm处的吸光值；Dt为样品溶液至总巯基溶液的稀释倍数。

(3)

式中：Y为面团的双硫键含量，mmol(以100 g小麦粉计)。

1.6 馒头制备、黄度测定和感官评价

1.6.1 馒头制备

将6个60 g新鲜面团或解冻后冷冻面团在温度 35 ℃、相对湿度80%的条件下醒发40 min，沸水蒸制20 min。待馒头自然冷却约20 min至室温后，进行感官评价和色调测定。

1.6.2 黄度测定

取长30 mm、宽10 mm的馒头表皮，对折，作为试样。采用色差仪测定在D65光源2°和10°视角下试样的黄度。

1.6.3 感官评价

馒头的感官评价根据文献[14]进行。感官评价小组由9名食品专业人员组成，感官评价项目和评分标准如表1所示。评价项目包括表面色泽、外观形状、内部气孔、气味、口味和口感等6项，评分标准分为5个级别。感官评价人员以市售新鲜馒头为参照标准品(各评价项目总分为100)，独立对6个馒头分别打分。

表1 馒头感官评价项目及评分标准

1.7 统计分析

各项测定重复3次。采用软件Excel 2013计算测定值、馒头感官评价得分的平均值和标准偏差，并进行单因素方差分析，P<0.05为样本平均值之间存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 冷冻面团的酵母发酵力、酵母细胞数和pH

冷冻面团酵母发酵力随NaHCO3用量的变化如图1所示。由图1可知，当NaHCO3用量为0(无NaHCO3)时，冷冻面团酵母发酵力为(680±9)mL，低于新鲜面团对照(无NaHCO3、无冷冻)的(710±8)mL(P<0.05)。冷冻面团酵母发酵力在0～0.6%的NaHCO3用量范围内随NaHCO3用量的增加而上升，当NaHCO3用量为0.6%时达到最大值(738±12)mL，高于新鲜面团对照(P<0.05)。然而，当NaHCO3用量大于0.6%时，冷冻面团酵母发酵力随NaHCO3用量的增加呈下降趋势。

图1 冷冻面团酵母发酵力随NaHCO3用量的变化

新鲜面团对照的醒发前酵母细胞数为2.0×1010个(以100 g小麦粉计)，醒发后酵母细胞数为(7.6±0.2)×1010个。冷冻面团醒发后酵母细胞数和pH随NaHCO3用量的变化如图2所示。虽然酵母细胞在面团冷冻和冻藏过程中会有部分死亡，但是在面团醒发过程中迅速生长。由图2可知，当NaHCO3用量为0时，冷冻面团醒发后酵母细胞数为(7.2±0.2)×1010个，低于新鲜面团对照的醒发后酵母细胞数(P<0.05)。与酵母发酵力同样，冷冻面团醒发后酵母细胞数随NaHCO3用量的变化呈先上升后下降的趋势。当NaHCO3用量为0.6%时，冷冻面团醒发后酵母细胞数达到最大值(7.7±0.3)×1010个，明显高于NaHCO3用量为0时的冷冻面团醒发后酵母细胞数(P<0.05)，且与新鲜面团对照醒发后酵母细胞数基本相同。很明显，酵母发酵力和细胞数之间存在相关性，活细胞数越多，发酵力越大。

图2 冷冻面团醒发后酵母细胞数和pH随 NaHCO3用量的变化

NaHCO3的使用提高了面团pH，随着NaHCO3用量从0增加到1.0%，pH从5.5±0.1线性上升到7.5±0.1。酵母细胞生长的最适pH为5.5[15]，pH的上升不利于酵母细胞生长。然而另一方面，当NaHCO3和酵母同时用于面团醒发时，适量的NaHCO3能提高酵母产淀粉酶的活性，从而促进直链淀粉转化为葡萄糖，有利于酵母细胞的生长[4,16]。但是，当NaHCO3用量过大时，较高的pH和Na+浓度会导致部分酵母细胞的死亡[17]。

2.2 冷冻面团的持气力和双硫键含量

冷冻面团持气力和双硫键含量随NaHCO3用量的变化如图3所示。由图3可知，当NaHCO3用量为0时，冷冻面团持气力为(263±3)mL，低于新鲜面团对照的(276±4)mL(P<0.05)，其主要原因是在冷冻面团中部分水形成冰晶，破坏了面筋结构[18-19]。此外，冰晶还会刺破酵母细胞膜，从细胞内释放的谷胱甘肽可还原面筋网络结构中的双硫键[20-22]。在0～0.6%的NaHCO3用量范围内，冷冻面团持气力随NaHCO3用量的增加而上升，在NaHCO3用量为0.6%时达到(283±3)mL，高于新鲜面团对照(P<0.05)。在0.6%～1.0%的NaHCO3用量范围内，冷冻面团持气力随NaHCO3用量增加的变化不显著(P>0.05)。冷冻面团中双硫键含量的变化趋势与持气力相同。当NaHCO3用量为0时，冷冻面团双硫键含量为(4.49±0.04)mmol(以100 g小麦粉计)，低于新鲜面团对照的(4.82±0.10)mmol(P<0.05)。随着NaHCO3用量从0增加到0.6%，冷冻面团双硫键含量从(4.49±0.04)mmol上升到(4.97±0.02)mmol，该变化显著(P<0.05)。然而，在0.6%～1.0%的NaHCO3用量范围内，冷冻面团双硫键含量随NaHCO3用量增加的变化不显著(P>0.05)。可以推测，面团中适量的NaHCO3促进双硫键形成，面筋结构更加致密，从而提高了冷冻面团的持气力。

图3 冷冻面团持气力和双硫键含量随NaHCO3用量的变化

面筋结构是由面筋蛋白(麦谷蛋白和醇溶蛋白)通过双硫键连接而成的三维网络结构[23-24]。麦谷蛋白半胱氨酸上的游离巯基被氧化成双硫键，面筋蛋白发生聚合反应，面筋结构增强[25-26]。面团的持气力与双硫键含量之间存在相关性，这是因为双硫键决定了面筋网络结构的形成、延伸性和稳定性。

面团中双硫键和面筋网络结构的形成受到盐、碱的影响。在面团中加入适量的食盐或食用碱(如Na2CO3、K2CO3、NaHCO3)，可以增加双硫键形成数量，加强面筋结构，从而提高面团的拉伸性、硬度、黏弹性和稳定性。但是，过量的盐或碱与面筋蛋白争夺水分，导致面筋蛋白水化不足，同时，过量的碱使pH变高，也会影响双硫键的形成[27]。在拉面面团延伸性的研究中，当小麦粉中复合碳酸盐(Na2CO3与K2CO3的质量比6∶ 4)添加量为0.2%时，面团的双硫键含量从2.0 mmol增加到2.5 mmol，面团拉力也从无复合碳酸盐添加面团的130 g上升到195 g。然而，当复合碳酸盐添加量大于0.2%时，由于面筋蛋白水化不足，面团拉力随复合碳酸盐添加量的增加呈下降趋势[28]。在荞麦馒头的研究中，快速黏度分析(RVA)、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、激光共聚焦显微镜(CLSM)观察结果显示，在荞麦粉与小麦粉的混合粉(质量比3∶ 7)中添加0.2%～0.6%的NaHCO3促进了荞麦馒头中蛋白质的交联，蛋白质网络结构更加连续致密；与此同时，随着NaHCO3用量的增加，淀粉糊化的峰值黏度和最终黏度明显增大，衰减值减小，淀粉溶胀程度变大并充分包裹在蛋白质网络结构中，从而改善荞麦馒头的感官品质[29-30]。从上述研究可知，本研究中冷冻面团中双硫键含量随NaHCO3用量的变化趋势与文献报道基本相同。应该注意的是，面团材料、水用量以及冷冻条件不同，则双硫键含量不同，NaHCO3对双硫键含量的影响也有变化。

2.3 馒头的感官品质

冷冻面团在一定条件下蒸制而成的馒头如图4所示。由图4可知，NaHCO3用量为0的面团醒发不良，导致馒头表层凹坑较多，表面缺少光泽。当NaHCO3用量大于0.2%时，面团醒发充分，馒头表面没有凹坑，光泽度较好。含NaHCO3面团醒发充分的原因在于：①NaHCO3(用量0.2%～0.6%)提高了酵母发酵力(图1)；②在蒸制过程中，NaHCO3发生分解反应，产生CO2。

图4 馒头照片(图中数据为NaHCO3用量)

当NaHCO3用量较大时，馒头颜色变黄。为了定量表示馒头变黄的程度，采用色差仪测定了馒头的黄度，结果如图5所示。由图5可知，NaHCO3用量0和0.2%的馒头黄度分别为33.6±0.7和34.5±1.4，两者差别不显著(P>0.05)。当NaHCO3用量大于0.2%时，馒头黄度随NaHCO3用量的增加呈线性上升。NaHCO3用量1.0%的馒头黄度上升到64.4。

图5 馒头黄度随NaHCO3用量的变化

表2表示馒头的感官评价得分。由表2可知，在NaHCO3用量为0时，馒头的气味(12.3±0.9)分、口味(19.3±1.0)分和口感(9.2±1.2)分，但表面色泽、外观形状和内部气孔得分均较低，分别为(8.8±2.0)、(8.2±1.3)和(9.3±1.0)分。表面色泽在0.2%～0.4%的NaHCO3用量范围内保持在(11.5±1.2)～(11.6±1.6)分基本不变(P>0.05)，然后随着NaHCO3用量的增加而降低。外观形状在0.2%～1.0%的NaHCO3用量范围内保持在(14.2±0.7)～(14.8±0.4)分基本不变(P>0.05)。内部气孔在0.2%～1.0%的NaHCO3用量范围内保持在(13.0±1.8)～(14.2±1.1)分基本不变(P>0.05)。气味在NaHCO3用量为0.2%时达到(14.9±0.4)分，然后随NaHCO3用量的增加而逐渐降低。口味在NaHCO3用量为0～0.2%时基本不变(P>0.05)，然后随NaHCO3用量的增加而逐渐降低。口感在0.2%～1.0%的NaHCO3用量范围内保持在(18.1±1.8)～(19.2±1.2)分基本不变(P>0.05)。

表2 馒头的感官评价得分

表2中，总分为各单项指标平均得分之和。NaHCO3用量为0时，总分仅为77.1。当NaHCO3用量为0.2%和0.4%时，总分分别达到92.6和90.2，表明该冷冻面团馒头的感官品质与市售新鲜馒头标准品基本相同。当NaHCO3用量大于0.4%时，总分随着NaHCO3用量的增加而大幅降低。总分的降低与表面色泽、气味和口味不良有关。

3 结论

采用一定用量的酵母和不同用量的NaHCO3制备冷冻面团，测定冷冻面团的酵母发酵力、酵母细胞数、持气力和双硫键含量。然后，将冷冻面团蒸制成馒头，对馒头进行感官评价，得到以下结果。

1)冷冻面团酵母发酵力随NaHCO3用量的增加而上升，在NaHCO3用量为0.6%时达到最大值。酵母发酵力的上升与酵母细胞数增加有关。适量的NaHCO3促进酵母细胞生长。当NaHCO3用量大于0.6%时，过高的pH导致了酵母细胞数和发酵力的下降。

2)冷冻面团持气力随NaHCO3用量的增加而上升，在NaHCO3用量为0.6%时达到最大值。当NaHCO3用量大于0.6%时，持气力无显著变化。适量的NaHCO3促进蛋白质双硫键形成，使面筋结构更加致密，从而提高了冷冻面团的持气力。

3)适量的NaHCO3能够显著改善冷冻面团馒头的感官品质。当NaHCO3用量为0.2%～0.4%时，冷冻面团馒头显示出较好的表面色泽、外观形状、内部气孔、气味、口味和口感，馒头感官评价的总分与市售新鲜馒头基本相同。