胰激肽原酶减轻单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化*

金文成， 金 健， 朴尚国， 李慧瑛， 姜玉姬， 玄美英， 郑海兰，金吉哲， 金英顺， 李 灿

（延边大学附属医院肾病学科，吉林延吉133000）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是危害全球人类健康的主要原因之一，其发生率因肥胖、糖尿病、高血压及长寿等原因逐年增加［1］。肾小管间质纤维化是大多数CKD患者的最终病理表现，结果可导致终末期肾病。单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）是肾小管间质纤维化的典型模型，表现为肾间质炎症反应、细胞外基质沉积及肾小管扩张、萎缩和纤维化的形成，其分子机制极其复杂，包括炎症介质、致纤因子、氧化应激和细胞凋亡等因素的参与［2-4］。

胰激肽原酶（pancreatic kininogenase，PK）属于丝氨酸蛋白酶，其作用于激肽原产生具有生物活性的激肽多肽。激肽结合缓激肽B1和B2受体通过动员细胞内钙离子产生一氧化氮、前列腺素和环磷酸腺苷等物质从而发挥生物学效应［5］。大量研究表明组织激肽释放酶及其转基因对高血压等心血管疾病、缺血性脑卒中、糖尿病及各种肾脏疾病具有治疗作用［6-8］。近期研究表明，激肽释放酶和激肽释放酶转基因可调节链霉素诱发的糖尿病模型中的血糖指标，并且改善脂质代谢［6］。在糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）模型中，激肽释放酶基因缺陷可加重链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病肾病中微量白蛋白尿的排出，而PK治疗不仅改善血糖，而且减轻了白蛋白尿，从而改善肾纤维化［7-8］。且在庆大霉素诱导的肾衰竭模型［9］、肾缺血-再灌注损伤［10］、高血压肾病［11］及多囊肾［12］等疾病中均观察到了胰激肽原酶对肾脏的保护作用。然而，PK是否对单纯UUO所致肾间质炎症反应、致纤因子、氧化应激、细胞凋亡及自噬等肾间质纤维化有治疗效果尚不明确，本实验利用UUO大鼠模型探讨PK抗肾间质纤维化的作用机制。

材料和方法

1 动物模型与药物治疗

38只雄性SD大鼠购自延边大学动物实验室（实验动物伦理编号为YBU2018-10-8），体重200～220 g，给予标准饲料和饮用水，经1周的适应期后随机分为假手术（sham）组（n=6）、UUO7组（n=8）、UUO+PK7组（n=8）、UUO14组（n=8）和 UUO+PK14组（n=8）。在苯巴比妥（40 mg·kg-1·d-1）麻醉下，UUO各组经侧腹切口行左侧输尿管结扎，假手术组仅游离输尿管后缝合皮肤。UUO7组和UUO14组大鼠经腹腔注射PK（7.2 U·kg-1·d-1；Changzhou Qianhong Bio-pharma Co.，Ltd.），假手术组给予生理盐水治疗，于第7和14天处死大鼠（实验中sham组第7天和14天各指标无统计学差异，故后续实验采用第14天结果），UUO7组和UUO+PK7组于第7天处死大鼠，UUO14和UUO+PK14组大鼠于第14天处死大鼠。收集血液、尿液、肾组织标本以备进一步检测。PK剂量选择基于以往文献报道［13］。

2 实验试剂

抗转化生长因子β1（transforming growth factor-β 1，TGF-β1）抗体购自R&D Systems；抗结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、超氧化物歧化酶 1（superoxide dismutase 1，SOD1）、NADPH氧化酶2（NADPH oxidase-2，NOX-2）、NOX-4、Bcl-2、Bax、LC3B、beclin-1、P62和超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2/MnSOD）抗体购自Abcam；抗单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和Toll样受体-2（Toll-like receptor-2，TLR-2）抗体购自 Santa Cruz；抗 cleaved caspase-3抗体购自Millipore。

3 主要方法

3.1 血、尿8-羟脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）水平的测定 根据试剂盒操作步骤用ELISA法测定血、尿8-OHdG DNA加合物水平。

3.2 肾脏病理组织检查 各组大鼠肾组织由过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛液（periodate-lysine-para formaldehyde solution，PLP）固定，石蜡包埋后切片，行Masson三色染色和HE染色，采用数字化显微镜分析仪（TDI Scope Eye Version 3.5 for Windows，Olympus）于高倍镜视野下分析肾小管间质纤维化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）程度。每个标本至少观察20个非重叠区域取平均数［14］。

3.3 免疫组织化学染色 免疫组化步骤简述如下：石蜡包埋切片置于二甲苯脱蜡，梯度乙醇中脱水，37℃下采用0.3%过氧化氢/甲醛处理30 min后，采用PBS液洗3次。置于微波炉中加热行波炉抗原修复（98℃，5 min）。室温下采用非免疫性血清封闭20 min。4℃下滴加抗ED-1单克隆抗体和抗osteopontin（OPN）抗体孵育12～16 h。PBS液洗3次后滴加Ⅱ抗，室温孵育2 h。以DAB为底物显色，呈棕黄色为止。自来水流水洗涤，复染苏木素，常规树脂封片。染色程度采用数字化显微镜分析仪（TDI Scope Eye™Version 3.0 for Windows，Olympus）中的Polygon 程序算出每0.5 mm2染色面积的阳性表达百分比。

3.4 TUNEL法检测细胞凋亡情况 根据ApopTag®in Situ Apoptosis Detection Kit（Millipore）试剂盒操作步骤测定细胞凋亡，200高倍下采用数字化显微镜分析仪计数TUNEL阳性细胞数。

3.5 电镜观察 肾皮质组织置于二甲胂酸钠溶液配制的戊二醛固定液中固定48 h，PBS冲洗3次，1%锇酸固定2 h，双蒸水冲洗，常规脱水、环氧树脂定向包埋，LKB-V型超薄切片机先行半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜定位后行超薄切片，厚50～70 nm，醋酸铀-枸橼酸铅双染色，1200EX（JEOL）型透射电镜观察。

3.6 Western blot实验 称取-80℃冻存的肾脏组织50～60 g（冰上操作）于1.5 mL的EP管中，加入500µL细胞裂解液（RIPA裂解液、PMSF和蛋白酶抑制剂复合物，现用现配），剪碎研磨，充分裂解30 min，之后于4℃、12 000 r/min离心20 min，吸取上清即为细胞总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）测定蛋白浓度。行SDS-PAGE，电转膜2 h后，4℃下置I抗于非脂牛乳中以1∶1 000浓度孵育12～16 h，PBS缓冲液洗3次后加辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（Amersham）孵育1 h，PBS缓冲液洗3次，增强发光（ECL™，Amersham）并曝光。计算目的蛋白与内参照蛋白的相对吸光度值的比值，对照组为标准（100%）测定条带，以β-actin为内参照。

4 统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Bonferroni post hoc校正，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PK减少UUO所致肾间质纤维化

肉眼可见UUO导致大鼠肾脏增大、肾盂扩张积水、皮质变薄，这种改变在UUO第14天尤为明显，见图1A。Masson染色和HE染色提示主要病变位于肾小管间质，表现为肾小管坏死、空泡形成、小管基底膜增厚、炎症细胞浸润、肾小管萎缩和间质纤维化，见图1B、1C；电镜检查清昕可见萎缩的、空泡变性的小管及束状胶原纤维在肾间质的沉积（图1D）。与sham组相比，UUO7组大鼠肾间质纤维化程度明显增加（P＜0.01），UUO14组明显高于 UUO7组（P＜0.05），UUO+PK7组与UUO+PK14组肾间质纤维化程度分别明显低于UU07组和UU014组（P＜0.05），定量计分系统分析表明PK可明显减少肾间质纤维化程度，且呈时间依赖性，见图1E。Western blot结果示，与sham组相比，UUO7组TGF-β1蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），UUO14组TGF-β1蛋白表达水平较UUO7组进一步升高（P＜0.05），而UUO+PK7组与UUO+PK14组TGF-β1蛋白表达水平分别均较UUO7组和UUO14组明显降低（P＜0.05）；CTGF及MMP2蛋白表达结果与TGF-β1蛋白表达结果相仿，结果示PK抑制UUO所致的TGF-β1、CTGF和MMP2的高表达，见图2。

2 PK减轻UUO所致的炎症反应

免疫组化结果显示，UUO导致大量的ED-1阳性细胞在肾间质浸润和炎症介质OPN的高表达（P＜0.05），PK治疗分别在UUO第7和14天均显著减少ED-1阳性细胞数和OPN的表达（P＜0.05），见图3A、B、D、E。另外，Western blot结果显示与sham组相比，UUO7组MCP-1蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），UUO14组的MCP-1蛋白表达水平明显高于UUO7组（P＜0.05），而UUO+PK7组与UUO+PK14组MCP-1蛋白表达水平较UUO7组或UUO14组均明显降低（P＜0.05），TLR-2蛋白表达结果与MCP-1蛋白表达结果大致相仿，说明PK下调MCP-1和TLR-2的表达且呈时间依赖性，见图4。

3 PK减轻UUO所致氧化应激

与sham组相比，UUO7组SOD1和SOD2蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），UUO14组SOD1和SOD2蛋白表达水平明显下降于UUO7组（P＜0.05），而UUO+PK7组与UUO+PK14组SOD1和SOD2蛋白表达水平分别较UUO7组和UUO14组均明显升高（P＜0.05）。反之，NOX-2和NOX-4表达结果可见，与sham组相比，UUO7组及UUO14组NOX-2和NOX-4蛋白表达水平明显升高，且随UUO时间递增（P＜0.05），而 UUO+PK7组与 UUO+PK14组 NOX-2和NOX-4蛋白表达水平分别较UUO7组和UUO14组均明显下降（P＜0.05）。Western blot结果表明PK通过增加SOD1和SOD2的表达，减少NOX-2和NOX-4的表达，保持氧化酶和抗氧化酶的平衡，见图5A。此外，本研究发现8-OHdG在大鼠血、尿中的含量随UUO时间递增（P＜0.05），PK治疗减少大鼠血、尿8-OHdG的含量（P＜0.05），见图5B。

4 PK减少UUO所致细胞凋亡

Figure 1.The pathological changes of kidney of rats in each group.Representative imagess of the kidney under gross observation（A），the photomicrographs of Masson trichrome staining（B）and HE staining（C），the images of transmission electron microscopy（D），and the quantitative analysis of tubulointerstitial fibrosis（E）were observed.D1：normal kidney structure in the sham-operated group（×10 000）；D2：tubular vacuolization and atrophy of obstructed kidney（×20 000）；D3：collagenous fiber deposition within the tubulointerstitium of obstructed kidney（stars，×30 000）；D4：tubular basement membrane thickening（arrows）and scattered interstitial collagen deposition（star，×30 000）；D5：swelling of the tubulointerstitium（ring）and inflammatory cell infiltration（arrowheads，×20 000）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.图1 各组大鼠肾脏组织的病理变化

Figure 2.The effect of PK on the protein expression of fibrogenic cytokines of kidney in rats was dtected by Western blot analysis.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.图2 Western blot法分析胰激肽原酶对大鼠肾脏组织中致纤因子蛋白表达的影响

Figure 3.The representative photomicrographs of immunohistochemistry for ED-1（A）and OPN（B）and transmission electron microscopy（C）with quantitative analysis（D and E）.C1：the inflammatory cell infiltration within tubulointerstitium（arrows，×10 000）；C2：the inflammasome（arrowhead，×30 000）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.图3 免疫组化和电镜检测各组大鼠肾脏组织中炎症介质和炎症细胞浸润

Figure 4.The effect of PK on the protein expression of inflammatory cytokines of kidney in rats was detected by Western blot analysis.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.图4 Western blot法分析胰激肽原酶对大鼠肾脏组织中炎症介质表达的影响

细胞凋亡参与了UUO肾损伤过程，高倍显微镜下可以观察到大量的TUNEL阳性细胞，利用电镜可清晰地观察到细胞核浓缩的凋亡小体，见图6A1，PK治疗不仅改善了肾间质纤维化，且减少了TUNEL阳性细胞数（P＜0.05），见图6A。在分子水平上，细胞凋亡调控因子Bcl-2/Bax比值结果发现，与sham组比较，UUO7组 Bcl-2/Bax水平明显降低（P＜0.01），UUO14组Bcl-2/Bax水平明显下降于UUO7组（P＜0.05），而UUO+PK7组与UUO+PK14组Bcl-2/Bax比值结果分别较UUO7组和UUO14组均明显升高（P＜0.05）。与sham组相比，UUO7组活化型caspase-3的水平明显升高（P＜0.01），UUO14组活化型caspase-3的水平明显高于UUO7组（P＜0.05），而UUO+PK7组与UUO+PK14组活化型caspase-3的水平分别较UUO第7和14天均明显降低（P＜0.05），见图6B。

Figure 5.The representative images of Western blot analysis of a series of oxidative stress-related proteins（A），and serum and urine concentrations of 8-OHdG（B）were showed.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.图5 Western blot分析氧化应激相关蛋白的表达及血、尿8-OHdG水平的分析

5PK减少UUO所致细胞自噬

电镜下可清晰观察到各种细胞自噬衍生物，如脂滴（图7A1）、髓样物（图7A2）、溶酶体（图7A3）和自噬体（图7A4）。采用Western blot法检测细胞自噬调控因子的表达，在分子水平上，细胞凋亡调控因子LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值结果发现，与sham组比较，UUO7组表达水平明显升高（P＜0.01），UUO14组表达水平明显高于UUO7组（P＜0.05），而UUO+PK7组与UUO+PK14组相关比值结果分别较UUO7组和UUO14组均明显下降（P＜0.05）。与sham组相比，UUO7组 beclin-1表达水平明显升高（P＜0.01），UUO14组beclin-1表达水平明显高于UUO7组（P＜0.05），而UUO+PK7组与UUO+PK14组beclin-1表达水平分别较UUO第7和14天明显降低（P＜0.05），P62表达结果与beclin-1蛋白表达结果大致相仿。结果提示PK可显著下调UUO所致LC3B、beclin-1和P62的高表达，见图7B。

讨 论

Figure 6.The effect of PK on apoptosis induced by UUO was detected by TUNEL staining（A），transmission electron microscopy（A1）and Western blot analysis（B）.Apoptotic body was shown in A1（arrow，×30 000）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.图6 TUNEL染色、电镜观察和Western blot分析PK对UUO所致细胞凋亡的影响

Figure 7.The effect of PK on autophagy was detected by transmission electron microscopy（A）and Western blot analysis（B）.A1：scattered lipid droplets（lipophagy，stars，×10 000）；A2：myelin body（red arrows，×20 000）；A3：autolysosome formation（blue arrows，×30 000）；A4：autophagosome formation（ring，×10 000）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.图7 电镜观察和Western blot分析PK对UUO所致细胞自噬的影响

研究表明，PK在心肌梗死、脉络膜新生血管性疾病及各种肾脏疾病中可抑制MCP-1和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症介质的表达、减少炎症细胞的浸润、下调TGF-β1的表达、防止细胞外基质的沉积，说明PK具有抗炎和抗纤维化的作用［13，15-16］。为揭示PK是否对UUO所致的肾间质纤维化也具有相同作用，本研究建立UUO大鼠模型，分别在7 d和14 d观察PK对UUO所致肾损伤的作用。结果表明PK可明显下调炎症介质MCP-1、TLR-2、OPN及致纤因子TGF-β1和CTGF的表达，继之减少炎症细胞浸润（ED-1阳性细胞数）和基质金属蛋白酶MMP-2的沉积。本研究结果与Bledsoe等［9］和Liu等［7］在庆大霉素肾毒性和链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病模型中PK所发挥的肾保护作用机制极为相似，提示PK通过抑制炎症介质和致纤因子的表达对UUO肾损伤发挥抗炎和抗纤维化的保护作用。

目前推测至少2种因素参与PK发挥抗炎和抗纤维化的保护作用。首先是氧化应激，众所周知UUO归根结底引起梗阻肾的缺血缺氧，其结果是以氧化酶活性增高和抗氧化酶活性下降为特点的氧化应激损伤，最终导致肾间质纤维化［17-18］，这种推断被许多研究所证实，譬如使用抗氧化剂维生素E治疗或环氧化物酶基因敲除小鼠表现为较轻的肾间质纤维化［19-20］。在糖尿病心肌病模型中，PK通过抗氧化作用减少肌纤维变性和间质胶原沉积［21］。类似地，PK减少糖尿病肾病小鼠的肾小球基底膜增厚和肾纤维化［7］；其次是细胞凋亡（Ⅰ型程序性细胞死亡），大量研究表明细胞凋亡在UUO所致的肾间质纤维化中扮演着重要角色［22］，理由是UUO可直接诱导肾小管上皮细胞凋亡［23］或间接通过氧化应激或TGF-β1诱导肾实质细胞凋亡［24-25］。因此，氧化应激、TGF-β1和细胞凋亡3者间有着相互关联、相互影响的关系。本研究结果表明，PK减少了血清和尿液中8-OHdG的水平，保持了氧化酶（NOX-2和NOX-4）及抗氧化酶（SOD1和SOD2）蛋白表达的平衡，趋于减弱氧化应激损伤，调节了细胞凋亡调控基因的表达、减少了TUNEL阳性细胞数。综上所述，PK减轻UUO所致肾间质纤维化与其抗氧化应激和抗细胞凋亡效应紧密相关。

除氧化应激和细胞凋亡外，细胞自噬（Ⅱ型程序性细胞死亡）在UUO所致肾间质纤维化进展中也起到关键作用。细胞自噬是通过降解受损的细胞质成分的一种细胞内自我防御过程，被生理性和病理性刺激所激活，尤其是细胞在缺氧和应激状态下。已知在UUO模型中，遗传性敲除远端小管Atg7基因或利用药物阻断细胞自噬可以加重肾间质纤维化程度，提示细胞自噬具有保护性作用［26-27］。然而，过度的细胞自噬恰恰相反，属于病理过程，它促进致纤因子的高表达，产生和堆积细胞外基质，使肌成纤维细胞分化、细胞凋亡、线粒体损伤，最终形成纤维化［28-29］。因此，细胞自噬发挥着双重作用，即使是在同一模型中，细胞血管的作用也取决于细胞的种类、细胞间复杂的“cross-talk”和模型中动物的血统。在本研究中，通过电镜检查清晰地观察到梗阻肾组织中存在大量的细胞自噬衍生物，包括脂滴、髓样物、溶酶体和自噬体等，PK治疗后这些物质明显减少。Western blot结果表明PK抑制细胞自噬调控因子（LC3B、beclin-1和P62）的高表达。因此，在本实验中细胞自噬参与了肾间质纤维化过程，而PK有效地防止纤维化与干预细胞自噬有关。

减少慢性肾脏病的发生有着重要的临床意义，其宗旨是改善人们的生活质量、减少社会的经济负担。临床上PK是血管扩张药物，主要应用于微循环障碍性疾病，尤其是糖尿病患者的周围神经病变。本研究利用临床常用药、采用多种检测手段，阐明了PK对UUO所致肾间质纤维化具有抗炎和抗纤维化作用，抑制氧化应激和程序性细胞死亡是其发挥肾脏保护作用的分子机制，这为临床上推广PK广泛应用提供了有力的理论依据。